论文：金钗石斛遗传多样性研究的随机扩增多态反应体系建立与优化
论文：金钗石斛遗传多样性研究的随机扩增多态DNA-PCR反应体系的建立与优化
作者：王燕燕 徐红 魏丹红 王峥涛
【摘要】 目的对影响金钗石斛随机扩增多态DNA（RAPD）-PCR扩增效果的一些因素进行优化，为进一步研究其遗传多样性奠定基础。方法对金钗石斛RAPD分析中一些重要影响因素进行比较系统的构建和优化，建立金钗石斛RAPD稳定可靠的反应体系。结果金钗石斛较适宜的RAPD-PCR反应条件为：10μl PCR反应体系中，5～20 ng 模板DNA，3.0 mmol·L-1Mg2+，0.34 mmol·L-1dNTPs，0.6 U Taq DNA聚合酶，1.5 μmol·L-1引物，较适宜的退火温度为36 ℃。结论所建立的金钗石斛RAPD反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强等特点，可用于金钗石斛的遗传多样性研究。以该优化的RAPD条件进行重复性实验，其实验结果重复性良好。
【关键词】 金钗石斛； 随机扩增多态DNA反应体系； 优化
Abstract：ObjectiveTo establish and optimize RAPDPCR system of D. nobile Lindl.MethodsThe reliable RAPD-PCR system for the genetic diversity study of D. nobile Lindl. established by systematically testing and optimizing the important concentrations of the factors. ResultsThe conditions that were suitable for RAPD-PCR of D. nobile Lindl. were as follows: 10 μl PCR reaction system contained 5～20 ng template DNA, 3.0 mmol·L-1Mg2+, 0.34 mmol·L-1 dNTPs, 0.6 U Taq DNA polymerase and 1.5μmol·L-1prime. The suitable annealing temperature in the RAPD-PCR reaction system was 36 ℃. ConclusionThe RAPD-PCR system, which was established in this paper for studying D. nobile Lindl., can provide clear, reliable, abundant polymorphic molecular markers,stable reaction system, and is suitable for studying the genetic diversity of D. nobile Lindl.. The experiment results are reproducible based on this conditions.
Key words：D. nobile Lindl.; RAPD reaction system; Optimization
金钗石斛Dendrobium nobile Lindl.又称金钗石、扁金钗、扁黄草、扁草、黄草，为兰科(Orchidaceae)石斛属Dendrobium Sw.植物，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳的功效，是中药石斛的主要来源之一。《本草纲目》中记载：金钗石斛可“强阴益精，厚肠胃，壮筋骨，暖水脏，补肾益力，轻身延年”等，是药用范围较广的名贵中药；又由于其花型奇特、花色艳丽，而具有较高的观赏价值［1］。近年来，我国学者对金钗石斛的生物学特性、药用价值、人工栽培、化学成分、药理、毒理等方面进行了较为广泛的研究［1～3］，而有关遗传多样性方面研究甚少。
随机扩增多态DNA（Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)技术是由Williams等于1990年创立的一种DNA分子标记方法，它可直接反映染色体组DNA多态性，能从遗传本质上揭示品种间多态性及亲缘关系，不受环境限制，具有操作简单快捷、成本低、通用性好、灵敏度高且不需预先了解基因组的相关分子生物学信息等优点［4,5］，被广泛应用于种质资源分析、生物种群划分、遗传相关分析、遗传图谱构建、基因定位等方面［6］。
本实验就模板浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度等影响RAPD反应的诸因素进行了构建和优化，建立多态性强、稳定性好的金钗石斛RAPD反应体系，为进一步研究金钗石斛的遗传多样性、开发利用这一珍稀药用资源提供技术支持。
1 材料与仪器
1.1 材料 金钗石斛，新鲜材料于2005年采自云南文山县，现保存于上海中医药大学中药研究所，材料经上海中医药大学中药研究所徐红博士鉴定原植物学名。
1.2 仪器 PTC-200型PCR仪（MJ Research公司）；凝胶成像系统（美国Pharmacia Biotech）；电泳仪（Bio-Rad）；核酸蛋白分析仪（美国Beckman）；离心仪（美国Beckman）。
1.3 试剂 CTAB、β-巯基乙醇、Tris Balanced Phonel、Tris、EDTA、琼脂糖均为分析纯；10×PCR buffer,Taq DNA polymerase (Taq酶),MgCl2,dNTPs 试剂购于上海生工公司；RAPD引物采用的为适于进行金钗石斛RAPD扩增的随机引物，由上海生工公司提供。
2 方法
2.1 总DNA的提取 采用改良的CTAB法。取新鲜叶片约1.2 g，用双蒸水洗净，加液氮手工研磨成细粉，迅速转移至4个10 ml离心管中，加入已65 ℃预热的2 % CTAB提取液5 ml，混匀，65 ℃保温2～4 h，期间多次轻轻颠倒混匀，使DNA提取充分；待提取液冷却至室温，加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)抽提10 min，12 000 r·min-1，离心10 min，吸取上清液，再用1/3体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)抽提10 min，12 000 r·min-1，离心10 min，吸取上清液，加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)萃取液，上下多次颠倒，萃取充分直至两相间无白色中间层，12 000 r·min-1，离心10 min，吸取上清液，加1/2体积的异丙醇，1/10体积的3 mol·L-1 NaAc，混匀，-20 ℃放置0.5～1 h，12 000 r·min-1，4 ℃，离心10 min，弃液，70 %乙醇洗涤沉淀物2次(4 ℃，12 000 r·min-1，离心5 min)，挥干至无醇味。其中一管加入适量TE液溶解，4℃保存备用，其余沉淀-20 ℃保存备用。
2.2 RAPD-PCR初始扩增体系 参考有关石斛RAPD分析的研究论文，确立本研究初始的反应体系条件，反应在10 μl的体系中进行，其中包括10×PCR buffer 1 μl，MgCl2 (25 mmol·L-1)0.8 μl，dNTP mix (10 mmol·L-1)0.3 μl，引物1.5 μl（10 μmol·L-1），Taq DNA polymerase (5 U·μl-1) 0.12 μl，模板溶液0.5～1 μl（5～10 ng），ddH2O补足10 μl。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，36 ℃复性45 s，72 ℃延伸2 min，循环37次，然后72℃保温5 min，使DNA片段完全延伸。反应结束后，产物置4 ℃冰箱保存。
2.3 RAPD扩增中各影响因素
2.3.1 模板DNA浓度 共同的PCR反应条件为10 μl PCR反应体积,10×PCR buffer 1 μl， MgCl2 (25 mmol·L-1)0.8 μl，dNTP mix (10 mmol·L-1)0.3 μl，引物1.5 μl（10 μmol·L-1），Taq DNA polymerase (5 U·μl-1) 0.12 μl，不同浓度的模板DNA浓度：① 5 ng；② 10 ng；③20 ng；④ 25 ng；⑤ 35 ng；⑥45 ng；⑦50 ng 。
2.3.2 Taq酶单位 共同的 PCR 反应条件：10μl PCR 反应体积,10×PCR buffer 1 μl，MgCl2 (25 mmol ·L-1)0.8 μl，dNTP mix (10 mmol·L-1)0.3 μl，引物1.5 μl（10 μmol·L-1），模板DNA浓度5～20 ng。 不同单位的Taq酶：①0.25 U；②0.5 U；③0.6 U；④0.75 U；⑤1.0 U。
2.3.3 Mg2+含量 共同的 PCR 反应条件：10 μl PCR 反应体积,10×PCR buffer 1 μl, dNTP mix (10 mmol·L-1)0.3 μl，引物1.5 μl（10 μmol·L-1），模板DNA浓度5～20 ng，0.6 U的Taq酶，不同浓度的Mg2+：①1.5 mmol·L-1；②2.0 mmol·L-1；③2.5 mmol·L-1；④3.0 mmol·L-1；⑤3.5 mmol·L-1。
2.3.4 dNTP浓度 共同的 PCR 反应条件：10 μl PCR 反应体积,10×PCR buffer 1 μl, MgCl2 (25 mmol·L-1)1.2 μl，引物1.5 μl（10 μmol·L-1），模板DNA浓度5～20 ng，0.6 U的Taq酶。不同浓度的dNTP：①0.14 mmol·L-1；②0.18 mmol·L-1；③0.22 mmol·L-1；④0.26 mmol·L-1；⑤0.30 mmol·L-1；⑥0.34 mmol·L-1；⑦0.38 mmol·L-1。
2.3.5 引物浓度 共同的 PCR 反应条件：10 μl PCR 反应体积,10×PCR buffer 1 μl, MgCl2 (25 mmol·L-1)1.2 μl，dNTP mix (10 mmol·L-1)0.34 μl，模板DNA浓度5～20 ng，0.6 U的Taq酶。不同浓度的引物：①1.4 μmol·L-1；②1.5 μmol·L-1；③1.6 μmol·L-1；④1.7 μmol·L-1；⑤1.8 μmol·L-1；⑥1.9 μmol·L-1；⑦2.0 μmol·L-1。
2.3.6 退火温度 共同的PCR反应条件：10 μl PCR反应体积,10×PCR buffer 1 μl, MgCl2 (25 mmol·L-1)1.2 μl，dNTP mix (10 mmol·L-1)0.34 μl，引物1.5 μl（10 μmol·L-1），0.6 U的Taq酶，模板DNA浓度5～20 ng。不同的退火温度：①30.9 ℃；②31.7 ℃；③32.8 ℃；④34.3 ℃；⑤36.0 ℃；⑥37.4 ℃；⑦38.5℃；⑧39.2 ℃。
2.4 PCR产物的鉴定 金钗石斛基因组DNA的RAPD扩增产物，以标准DNA GeneRulerTM DNA Ladder Mix和1 kb DNA Ladder为分子量标记，于1.5 %的琼脂糖凝胶（加入EB 0.4 μg·ml-1）、5 V/cm电压下电泳分离扩增产物，电泳缓冲液为0.5×TBE，电泳80 min后在凝胶成像系统下成像。
2.5 RAPD优化体系的验证采用不同的引物应用优化好的RAPD体系对具有代表性的样本个体进行RAPD扩增。
3 结果
3.1 模板DNA的检测DNA经0.8％的琼脂糖凝胶电泳(0．5×TBE，0.4 μg·ml-1 EB)，电压125 V，电泳120 min，通过Image Master VDS凝胶成像系统观察，显示结果(图1)表明，抽提出的DNA以大片段形式存在（>10 000 bp），表明此种方式的DNA提取方法可行，所提取出的DNA可用于金钗石斛的RAPD分析。
3.2 模板DNA浓度模板DNA的浓度在0.5到1.0 ng·μl-1时扩增条带少于高浓度模板扩增条带，在2.0～2.5 ng·μl-1时扩增出基本相同的带型,且亮度相当，在3.5～5.0 ng·μl-1时部分条带亮度变暗。见图2。 图1 总基因组DNA检测（略） 图2 不同模板DNA浓度RAPD扩增效果（略）
3.3 Taq酶单位Taq酶浓度在0.25 U，0.5 U时扩增条带数少，0.6 U，0.75 U时扩增条带相当，1.0 U时又变少，且0.6 U较0.75 U时扩增出的条带清晰可见。见图3。 图3 不同Taq酶浓度RAPD扩增效果 （略）
3.4 Mg2+浓度Mg2+浓度在3 mmol·L-1时条带多态性高且最清晰，浓度为1.5 mmol·L-1时无条带产生，2.0，2.5 mmol·L-1时条带数少，达到3.5 mmol·L-1时多态性又降低。见图4。
3.5 dNTP浓度dNTP浓度在0.14～0.26 mmol·L-1时扩增条带少且亮度较低，在0.30～0.38 mmol·L-1时扩增出基本相同的带型。但当浓度在0.34 mmol·L-1时短片段的亮度较0.38 mmol·L-1时亮。见图5。 图4 不同Mg2+浓度RAPD扩增效果（略） 图5 不同dNTP浓度RAPD扩增效果（略）
3.6 引物浓度引物浓度在1.5～1.8 μmol·L-1时扩增条带基本一致且亮度相当，浓度在1.4μmol·L-1时扩增条带数少于1.5～1.8 μmol·L-1扩增条带。浓度为 1.9，2.0 μmol·L-1时多态性降低且扩增条带变淡。见图6。 图6 不同浓度引物S201RAPD扩增效果（略）
3.7 退火温度结果表明，退火温度在36 ℃时效果最好，条带最亮且稳定性高。见图7。 图7 引物S372不同退火温度RAPD扩增效果（略）
3.8 RAPD优化体系的验证通过多次实验结果表明（部分图谱见图8～9）本实验得出的金钗石斛的RAPD体系重复性强，稳定性好，能够应用此技术继续进行金钗石斛的遗传多样性研究。 图8 引物S99，S372的扩增图谱（略） 图9 引物S201，S276的扩增图谱（略）
4 讨论
鉴于RAPD技术具有操作方便、多态性好、灵敏度高等优良品质而被广泛应用，所以在对濒危药用植物金钗石斛进行研究之前，构建稳定的RAPD体系是必需的。
DNA模板含量是PCR扩增的重要影响因素，含量过高会出现非特异性扩增条带甚至抑制扩增，过低则得不到所需的扩增产物［7］。从已发表的文献看，RAPD实验的模板浓度范围较大，但是加入的量也不能过多，如果加入过多的量，在浪费模板的同时，还可能存在着随着反应体系中模板数量的增加，DNA提取过程中未去净的Taq酶活力抑制物的量相应增加，达到一定程度时，将导致PCR扩增失败［8］。RAPD对非目的模板DNA的污染反应敏感，所以在DNA的提取、浓度测定、稀释、扩增过程中应避免其他来源DNA的污染。其次在抽提DNA的过程中，还应避免模板的严重降解，否则会使扩增带的数量减少［9］。朱苏文等［10］发现在DNA提取过程中，粘质等次生物质与DNA结合成非常粘稠的胶状物质，用异丙醇沉淀DNA后，4℃条件下很难去除，但是在20℃离心可以去除一些次生物质，且去除次生物质的效果CTAB比使用KAc好。
TaqDNA聚合酶浓度过高可以引起非特异性扩增，产物电泳时产生弥散带，使得背景加深且成本提高，造成浪费。浓度过低时，体系的反应活力降低，产物减少，条带变弱减少。另外，尽量在同一实验中使用同一批号的酶也是减少实验影响的一个因素［11］。
用于RAPD反应的镁离子的浓度一般选择1～5 mmol·L-1 ［12，13］。孟现东等研究发现大部分木本植物的PCR扩增都需要较高的Mg2+浓度。 Mg2+不仅会影响Taq酶的活性，还会影响引物与DNA 模板的结合效率、模板与PCR产物的解链温度以及产物的特异性和引物二聚体的形成。若Mg2+浓度过低，加上dNTP和溶液中EDTA对Mg2+的螯合作用，没有足够的Mg2+来激活Taq酶的活性，将导致扩增产物减少甚至整个反应失败。而Mg2+过高，反应严谨性降低，非特异性产物将大大增加。但是反应体系中所示Mg2+浓度并不一定是参加反应的游离Mg2+浓度，因为反应体系中DNA模板的浓度、纯度、引物、dNTP均会影响Mg2+浓度［14］。
dNTPs是反应中磷酸基团的主要来源。有报道指出使用较低的dNTPs浓度比使用高浓度dNTPs会减少聚合酶在非靶位置的启动和延伸时核苷酸的错误码掺入，可提高特异性与精确性［15］。但是dNTP浓度过低，在反应过程中过早地消耗完，此后的循环过程无延伸反应，扩增产物将单链化。
反应混合物中，过量的引物才能确保模板DNA一旦变性就与引物结合，而不是与其自身退火。但如果引物模板比太高，则倾向于产生非特异性产物，而且易形成引物二聚体。引物浓度过低时，不足以扩增出供EB染色的DNA量。
反应程序中，变性温度以及变性时间对模板解开双螺旋有重要作用，它直接关系到以后步骤的成败。复性温度对PCR的特异性十分关键，过高会使引物和模板结合不上；过低会导致引物与模板的非特异结合，使扩增的特异性下降。一般RAPD的复性温度在35～37 ℃之间［16］。PCR反应循环次数决定了扩增产量，循环次数太少，PCR产物量低；循环次数过多，一旦达到反应极限，以后的循环不但不能使产物量增加，反而可能导致非特异扩增。
根据电泳结果，若条带清楚、背景低、数目适当，该体系稳定可重复，那么该反应体系就是一个稳定的、可用的优化体系。
目前，RAPD技术在金钗石斛的研究应用方面尚无报道，本研究通过多次实验考察建立了金钗石斛的重复性较好、分辨率高的RAPD-PCR反应体系。引物其较适宜的PCR反应条件为：10 μl PCR反应体系中，5～20 ng 模板DNA，3.0 mmol·L-1 Mg2+，0.34 mmol·L-1dNTPs，0.6 U Taq DNA聚合酶，1.5 μmol·L-1引物，较适宜的退火温度为36 ℃。
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