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初步探讨枫斗类药用石斛的综合鉴定方法

2020-03-01 09:27:57 0
摘要: 枫斗类石斛药材是一种较为常见的商品石斛,其种类多而复杂。本文利用性状、显微和HPLC鉴定方法对14种枫斗类石斛药材进行综

 摘要: 枫斗类石斛药材是一种较为常见的商品石斛,其种类多而复杂。本文利用性状、显微和HPLC鉴定方法对14种枫斗类石斛药材进行综合鉴定。结果表明,性状鉴定方法只能鉴别矮石斛Dendrobium bellatulum和黑毛石斛D. williamsonii,而不能够鉴别其余种类;显微鉴定方法除了叠鞘石斛D. denneanum、重唇石斛D. hercoglossum和美花石斛D. loddigesii外,对其余枫斗类石斛都能进行鉴别;HPLC鉴定方法均能对14种枫斗类石斛药材进行鉴别。笔者认为,多种鉴定方法的综合应用是解决枫斗类石斛药材鉴别问题的有效途径。

关键词:枫斗类石斛;性状;显微;HPLC;综合鉴定方法.

我国商品石斛的类别及规格等级多种,如金钗石斛类、霍山石斛类、环草石斛类、黄草石斛类、枫斗(耳环石斛)类、鲜石斛类、金黄泽、圆石斛类、马鞭石斛类、小瓜石斛类和大瓜石斛类等。近年来,笔者对我国安徽、浙江、广东、广西、云南和贵州等省区的商品石斛进行调查,发现商品石斛种类除了上述11种外,还有青皮、石霍头和石霍尾等商品石斛。枫斗是利用兰科石斛属植物中的一些植株矮小、茎肉质粗壮、质地柔软和黏性较大的茎,经多道工序而成的天然中药与保健饮品[1]。中国药典(2005版)只收载了铁皮枫斗(耳环石斛)1种,其原植物为铁皮石斛D. candidium(D. officinale),但枫斗类药材种类很多,如铁皮枫斗、金霍斗、西枫斗和紫皮枫斗等,而且目前市场上能够加工成枫斗类石斛的药用石斛也不止铁皮石斛1种,几乎能够加工成螺旋形或弹簧状,茎柔软性的药用石斛均可加工成枫斗类石斛。本文利用性状、显微和HPLC鉴定方法对几种典型的枫斗类石斛进行研究,明确较有专属性的鉴别特征及能够鉴别的枫斗类石斛种类,建立枫斗类石斛的综合鉴定方法,为枫斗类石斛的准确鉴别提供平台。

1.材料与方法
 
1.1 材料

 
笔者对浙江、广东、贵州、广西以及北京等省市地区的商品石斛进行调查,同时查阅相关文献[1,2,3],发现目前在市场上流通的主要枫斗种类有16种,其原植物有14种(表1)。试验所用的枫斗类石斛药材原植物于2004年8至2006年3月之间,采自云南、贵州、广西和安徽等石斛主产区。

1.2 方法
 
(1)枫斗类鲜品石斛和干品石斛中能够观察和测量的性状特征比较多,根据观察和测量难易程度,本文共选用鲜品质地、干品质地、干品直径、茎表面纵沟和茎表面颜色等16个较有专属性性状特征用于鉴别枫斗类石斛。
 
(2)按照石蜡切片制作方法,制作枫斗类石斛茎中部节间的石蜡切片,用LEICA RM2155半薄切片机,切成厚度为8~12µm的半薄切片,用LEICA DM/LS双筒光学显微镜观察其茎组织构造,并做好记录和照相。从枫斗类石斛茎组织构造(表皮、基本组织和维管束)中,能够观察到很多茎显微特征,本文共选用角质层厚度、表皮细胞切向直径和径向直径、表皮细胞的细胞壁增厚、皮下层细胞层数和草酸钙结晶体等17个具有鉴别意义的显微特征用于鉴别枫斗类石斛。
 
(3)枫斗类石斛药材的HPLC鉴定  ①供试品溶液的制备:石斛药材粉碎,过40目筛,取粉末1.0g,置具塞三角瓶,10%氨水润湿20min,加氯仿20mL,静置1h,超声提取40min,提取液水浴挥干,冷却,加50%甲醇溶解,5mL定容。用0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,作为供试溶液。②色谱条件:色谱柱:Agilent TC-C18(250mm×4.6mm,5μL);流动相甲醇(A)-水(B),梯度洗脱0~5min A 35%、10min A 40%、20min A 45%、30min A 50%、40min A 60%、50min A 70%、60min A 80%;流速1.0ml/min;进样量20μL;柱温25℃;检测波长300nm。
 
(4)用SPSS11.5统计软件的类间平均链锁方法进行聚类分析,并建立聚类图。
 


2. 结果与分析
 
2.1. 枫斗类石斛药材的性状鉴定结果
 

聚类分析结果表明(图1),性状鉴定方法只能鉴别矮石斛和黑毛石斛,不能鉴别其它12种枫斗类石斛,说明具有较为专属性性状指标特征并不多,必须借助其它鉴定方法进一步鉴定。矮石斛和黑毛石斛为石斛属黑毛组(Sect. Formosae)植物,聚类图上两者与其它枫斗类石斛之间的分支产生的时间较早,说明它们在性状特征上存在较大差异。该两种植物的叶和叶鞘被黑毛、叶片着生于茎上部、叶鞘无明显的条纹以及无套叠现象。说明这些性状特征对枫斗类石斛鉴别具有重要参考意义。

2.2 枫斗类石斛的显微鉴定结果
 

聚类分析结果表明(图2),在14种枫斗类石斛中,显微鉴定方法能够鉴别其中的11种,而叠鞘石斛、重唇石斛和美花石斛没有鉴别出来,说明显微鉴定方法能够鉴别大多数枫斗类石斛,而且较有专属性显微鉴别指标比较多。如茎表皮细胞,笔者观察40余种药用石斛及其混淆品的茎表皮细胞,发现其细胞壁增厚情况在种间具有明显差异。兜唇石斛、晶帽石斛、美花石斛和报春石斛茎表皮细胞的细胞壁增厚不明显,其厚度与薄壁细胞的细胞壁厚度接近;束花石斛、铁皮石斛和叠鞘石斛茎表皮细胞的细胞壁除内切向面外,左右径向面和外切向面均增厚;球花石斛和密花石斛表皮细胞的细胞壁左右茎向面和内外切向面均增厚,而且明显大于皮下层细胞,不过该两种药用石斛很少用于加工枫斗。除了表皮细胞外,皮下层细胞大小和形状对枫斗类石斛鉴别也有一定的价值。

2.3 枫斗类石斛药材的HPLC鉴定结果
 
14种枫斗类石斛药材HPLC色谱峰数据的聚类分析结果表明,HPLC鉴定方法完全可以鉴别14种枫斗类石斛药材,说明该鉴定方法适用于鉴别枫斗类石斛(图3)。HPLC色谱数据的聚类分析不仅有助于鉴别枫斗类石斛,而且还可以判断枫斗类石斛化学成分的相似性。从图3可见,矮石斛和黑毛石斛形成一个分支,而且相似度很高,说明两者化学成分可能比较相似。

3. 讨论
 
枫斗类石斛药材鉴定一直是难度较大的一项课题,丁小余等构建21种枫斗类石斛ITS全序列数据库,为枫斗类石斛鉴定提供了分子鉴别依据[3]。
 
药用石斛茎加工成各种枫斗类药材之后,有些性状特征的确很难观察,甚至会缺失,如叶鞘条纹和套叠以及叶和叶鞘被毛等性状特征;但是有些性状特征加工之后仍然可以很容易观察和区别,如各种枫斗类石斛的茎直径、表面纵沟和形状等性状特征仍然能够体现其原植物的一些特征。
 
另外,石蜡切片制作过程目前有比较成熟的试验方案,而且同一种枫斗类石斛的茎显微特征的变异较小,因此只要明确其较有专属性的显微特征,就能对枫斗类石斛的鉴别提供重要的参考依据。
 
枫斗类石斛化学成分差异较大,并能够反映在其HPLC色谱图上,这些HPLC色谱指纹特征对枫斗类石斛的鉴别及质量评价都一定的重要参考依据。HPLC鉴定方法灵敏度高,重复性好,试验结果表明,该鉴定方法非常适用于鉴别枫斗类石斛。
 
笔者认为,对于枫斗类石斛的鉴定,应首选性状显微鉴定方法,因为性状显微鉴定方法比较简单,易行。在性状显微鉴定方法还不能完全鉴定的情况下,选用HPLC鉴定方法。因为DNA分子鉴定方法的试验成本相对较高,因此利用上述三种鉴定方法仍不能鉴别的枫斗类石斛,则考虑使用DNA分子鉴定方法。因此,充分挖掘和运用各种鉴定方法的优点,建立一个综合鉴定方法是解决枫斗类石斛药材鉴别问题的行之有效途径。
 


参考文献
 
[1] 包雪声,等. 中国名贵传统中药与保健品――枫斗. 上海科学技术文献出版社, 2004.
 
[2] 包雪声, 等. 中国药用石斛. 上海: 上海医科大学出版社;复旦大学出版社, 2001.
 
[3] 丁小余, 等. 枫斗类石斛rDNA ITS区的全序列数据库及其序列分析鉴别. 药学学报,2002,37(7):567-573.
 
     白音1  包英华1  王文全2    阎玉凝2    陈耿3   王汉友4 
 
(1. 韶关学院英东生命科学学院,广东韶关,512005;2.北京中医药大学中药学院,北京,100102;3. 新丰县长荣生物科技有限公司,广东韶关新丰县,511100;4.广东省仁化县鑫宇生态开发有限公司,广东韶关仁化县,512300;)