论文：超声波辅助热回流技术提取马鞭石斛多糖的工艺研究
论文：超声波辅助热回流技术提取马鞭石斛多糖的工艺研究
作者：罗傲雪，何兴金，范益军，何涛，刘静，淳泽
【摘要】 目的优选超声波辅助热回流法提取马鞭石斛多糖工艺。方法以多糖的提取率作为指标，通过单因素及正交实验对提取工艺进行优化，主要考察因素为提取时间、温度和次数。结果超声波辅助热回流提取马鞭石斛多糖的最优工艺条件：温度95℃，时间16 min，提取4次，采用此工艺提取的马鞭石斛多糖提取率为（18.64±0.396）%，显著高于传统热回流法的提取率。结论该工艺具有良好的精密度和稳定性，重复性好，适用于马鞭石斛多糖的提取。
【关键词】 超声波辅助提取； 多糖； 马鞭石斛； 提取工艺
Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction process of polysaccharide from D.fimbriatum Hook.var.oculatum Hook by ultrasonic hot reflux assisted.MethodsOn the basis of single factor experiments, the extraction process was optimized by orthogonal experimental design on effects of extraction temperature, ultrasonic-irradiation time and extraction times. The yield of polysaccharide was used to evaluate the factor levels.ResultsThe optimum conditions were determined as follows: ultrasonic-irradiation 16 min at 95℃ and extraction four times. The extraction rate of polysaccharide reached （18.64±0.40）% by using the method, which was much better than hot reflux extraction method. ConclusionThat the method is simple with high accuracy, good stability and reproducibility, and can be used to extract polysaccharide from D.fimbriatum Hook.var.oculatum Hook.
Key words：Ultrasonic-assisted extraction; Polysaccharide; D.fimbriatum Hook.var.oculatum Hook; Extraction process
石斛为兰科石斛属植物，是一种重要的大宗中药材，民间将其称为药界大熊猫，与灵芝、人参、冬虫夏草等并称为“中华九大仙草”［1］。传统中医常将石斛用于滋阴清热、生津益胃、止咳润肺，而现代药理学研究发现石斛具有多种医药功效，可预防和治疗白内障，扩张血管、降血糖等［2，3］。
石斛的有效成分主要是多糖和生物碱，其中多糖由于具有抗氧化［4］、免疫增强［5，6］和抗肿瘤作用［7］而成为研究热点。马鞭石斛是四川主产的石斛品种之一，资源非常丰富，被2000年版和2005年版《中国药典》收载。初步研究表明，马鞭石斛中含有丰富的多糖类成分［8］，然而目前对马鞭石斛多糖的提取工艺及活性研究尚未见报道。本实验旨在热回流提取基础上，结合超声波辅助处理来研究马鞭石斛多糖的提取工艺，并通过对提取条件的优化，筛选最佳工艺，为马鞭石斛的进一步开发提供依据。
1 材料与仪器
葡萄糖、苯酚、硫酸、乙醇、石油醚，均为分析纯试剂（成都科龙化工）。马鞭石斛（采自四川夹江，并经中国科学院成都生物研究所何涛副研究员鉴定），60 ℃下烘干并过40目筛。
TU-1800S紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器）；RE-52A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器）；HH-S数显恒温水浴锅（江苏金坛医疗仪器）；T214分析天平（北京赛多利斯仪器）；KQ-5200超声波发生装置（昆山超声仪器）；6202植物粉碎机（北京环亚天元机械）；AYJ1-1002-U艾柯浦纯水仪（重庆颐洋企业发展有限公司）。
2 方法 2.1 超声波辅助热回流提取流程 马鞭石斛→60℃干燥→粉碎过40目筛→称取石斛干粉→石油醚回流去脂→80%乙醇回流去低聚糖→超声波辅助热回流提取→紫外分光光度计检测吸光度。
2.2 标准曲线的制备 对照品溶液的制备：精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品0.025 0 g，加水溶解，250 ml容量瓶定容，即得0.1 mg·ml-1的葡萄糖对照品液。
标准曲线的制备：精密量取上述对照品液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml于具塞试管中，分别加水至2.0 ml，各加入5%苯酚溶液1.0 ml，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0 ml，摇匀，放置10 min，置40 ℃水浴保温15 min，取出迅速冷却至室温，紫外分光光度计490 nm处测定吸光度，空白对照以2.0 ml蒸馏水代替葡萄糖液。以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为： Y=0.068 6X-0.000 3（r=0.999） 式中Y——浓度（mg·ml-1）；X——吸光度值（A）多糖的提取率按下式计算： 多糖的提取率（%）=浓度×稀释倍数×样品溶液体积样品质量×100%
2.3 单因素实验温度对多糖提取的影响 分别考察40，50，60，70，80 ，90 ℃对多糖提取率的影响。时间对多糖提取的影响主要考察4 ，8，12，16，20，24，28 min 7个水平；以筛选的最佳温度和提取时间考察超声波提取次数（1，2，3，4次）对马鞭石斛多糖提取的影响。
2.4 提取工艺正交实验设计在单因素实验基础上，对提取温度、提取时间和提取次数进行L9(34)正交实验，筛选最优提取工艺。对筛选出来的最优提取工艺进行精密度、重复性、稳定性等方法学考察，同时将其与传统热回流工艺的提取效率进行比较。
2.5 实验设计和数据统计分析实验过程中所有处理都设3个平行样，实验数据利用SPSS软件分析。
3 结果
3.1 单因素实验
3.1.1 提取温度对多糖提取的影响
以超声波提取16 min，提取1次，考察温度对提取率的影响，结果见图1。随温度的升高，多糖的提取率显著增大，但当温度达到90℃后，提取率增加不明显，故选取90 ℃作为提取温度筛选其他因素。
3.1.2 提取时间对多糖提取的影响
以提取温度90℃，提取1次，考察超声波提取时间（4，8，12，16，20，24，28 min）对马鞭石斛多糖提取的影响。结果见图2。随提取时间的增加，多糖的提取率显著增大，但当时间达到16 min后，提取率却略有降低，故选取16 min作为提取时间筛选其他因素。
3.1.3 提取次数对多糖提取的影响
以提取温度90 ℃，提取时间16 min，考察超声波提取次数（1、2、3、4次）对马鞭石斛多糖提取的影响。结果见图3。表明随提取次数的增加，多糖的提取率显著增大，但提取3次以后，随着提取次数的增加，提取率增加缓慢。由于提取次数的增加，成本迅速增加，因此实际生产中，提取次数不宜过多，故选择2～4次来进行正交实验。
3.2 正交实验在单因素实验基础上，对提取温度、提取时间和提取次数进行L9(34)正交设计见表1，结果见表2。表1 超声波辅助提取正交实验设计，表2 正交实验结果（略）
实验因素的主次分析：从表2中可知，极差值中RC为17.38，RB为5.46，RA为4.9。说明C因素（提取次数）影响最大，其次是B和A，影响因素主次顺序为C>B>A；优水平为A3B2C3，即温度为95 ℃，时间为16 min，提取4次。
实验因素显著性分析：从表3可知，提取温度，时间均对马鞭石斛多糖提取具有显著影响，而提取次数具有极显著影响。表3 正交设计方差分析（略）
3.3 精密度实验按照最优工艺制备
马鞭石斛多糖样品液1份，同时取样5次，紫外分光光度计490 nm处测定吸光度，检测方法的精密度。结果表明，5个样品液的吸光度分别为0.412，0.404，0.419，0.410和0.417，平均值为0.412，样品液的吸光度的RSD=1.441%（n=5），表明本方法精密度良好。
3.4 稳定性实验分别在0，30，60，90，120 min检测
按最优提取工艺制备的样品液的吸光度，考察该方法在120 min内的稳定性。结果表明，样品吸光度（A）分别为0.415，0.416，0.409，0.407和0.405，样品吸光度的RSD=1.189%（n=5），不同时间点检测的样品液的吸光度值无显著差异，表明样品液和标准液在120 min内基本稳定。
3.5 重复性实验
按照筛选出的最优提取工艺分别制备5份样品液，测定其吸光度值。5份样品的吸光度值无显著差异，RSD=1.700%（n=5），表明该方法具有良好的重现性。
3.6 超声辅助热回流提取与传统热回流提取效率的比较 将筛选出来的最优工艺与传统热回流提取2h的提取效率进行比较。结果表明，超声波辅助热回流提取法的多糖提取率为（18.64±0.396）%，而传统热回流法的提取率为（12.07±0.100）%，说明采用超声波辅助热回流提取马鞭石斛多糖不仅缩短了提取时间，而且显著增大了提取率。
4 讨论
实验建立了利用超声波辅助热回流技术提取马鞭石斛多糖的方法。通过正交设计对提取温度、时间以及提取次数进行优化，结果表明提取次数对马鞭石斛多糖提取具有显著的影响，优水平为A3B2C3，即温度为95 ℃，时间为16 min，提取4次。经方法学考察，本方法具有良好的精密度和稳定性，且重复性好。
与传统热回流法相比，超声波辅助热回流技术最大的优点就是提取时间短、效率高，大大节省了生产能耗，这一点也可以从我们的实验结果中得到佐证。分析原因，可能正是由于超声波的机械效应、空化效应和热效应，增大了介质分子的运动速度和介质的穿透力，从而更好的提高了有效成分的提取效率。
目前利用超声波技术提取天然产物时，通常未结合加热处理，直接利用超声波自身产生的热效应来增大提取率，但超声波的热效应毕竟是瞬时的，对于提取率的增加效应较弱。因此实验在采用超声波提取的同时，结合热回流技术提取马鞭石斛多糖，并对提取条件进行优化，寻找节时、节能、得率高的提取工艺，为其工业生产提供实验依据。
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