论文：美花石斛RAPD-PCR反应体系的建立
论文：美花石斛RAPD-PCR反应体系的建立
作者：白音，包英华，王文全, 阙生全，谭庆辉
【关键词】 美花石斛；,,基因组DNA；,,RAPD-PCR反应体系
摘要：目的建立美花石斛基因组DNA 的RAPD-PCR最佳反应体系。方法在提取纯化美花石斛基因组DNA的基础上，利用PCR扩增技术和方法，对Mg2+，dNTP，模板DNA，引物，Taq聚合酶等反应条件进行优化。结果反应体系的最佳条件是总体积为25 μl，其中Mg2+ 浓度1.2 mmol・L-1，Taq聚合酶1.2U，引物浓度0.3 mmol・L-1，模板DNA 46 ng和dNTPs 160 mmol・L-1；PCR扩增程序为94℃预变性3 min，94℃变性50 s，40℃退火1 min，72℃延伸2 min，循环40次，72℃延伸5 min。结论该反应体系具有经济，简便以及扩增条带较清晰而稳定等特点。
关键词：美花石斛； 基因组DNA； RAPD-PCR反应体系
Abstract:ObjectiveTo establish the best reaction condition of RAPD-PCR amplification system of Dendrobium loddigesii. MethodsSome reaction condition was optimized by amplifying technology and method of PCR based on isolating genomic DNA from D. loddigesii. ResultsThe best amplification system for D. loddigesii was as follows: total reaction volume 25 μl, including 1.2 mmol・L-1 Mg2+，1.2 unite Taq polymerase, 0.3 mmol・L-1 random primer, 46 ng template DNA and 160 mmol・L-1 dNTPs; the amplification procedure conditions were pre-denature at 94℃ for 3 min followed by denature at 94℃ for 50 s, annealing at 40℃ for 1min, extension at 72℃ for 2 min,cycling 40 times, last extension at 72℃ for 5 min. The PCR amplification bands for five individuals of this species were very stable and clear in this RAPD-PCR amplification system. ConclusionThis amplification system is very economical, convenient, and the band is clear and stable.
Key words:Dendrobium loddigesii; Genomic DNA; RAPD-PCR amplification system
美花石斛Dendrobium loddigesii Rolfe为兰科（Orchidaceae）石斛属多年生草本植物，又称环草石斛、粉花石斛或耳环石斛等，主要分布于贵州、广西、云南和广东等少数几个省区。美花石斛是我国常用名贵中药材，具有滋阴清热、生津益胃和润肺止咳等功效，含有多糖、生物碱和Stilbenoids类等化学成分［1~3］。由于在自然环境中，美花石斛的种子萌发率很低，再加上长期过度采收，导致野生美花石斛种质资源急剧减少，甚至难以找到较为完整的野生居群。于1987年出台的《中国珍稀濒危保护植物名录》中，美花石斛（环草石斛）被列为国家三级珍稀濒危保护植物之一。自200503~04，课题组成员奔赴云南、贵州、广西和广东等省区，考察美花石斛种质资源时发现不同产地的美花石斛种内具有丰富的遗传变异。然而，目前尚未见到有关美花石斛种内遗传变异方面的研究报道。RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）是1990年由J.G.Williams等［4］和J.Welsh等［5］同时推出的一种分子标记技术，是以PCR反应为基础，以随机碱基寡核苷酸为引物，对基因组DNA进行扩增而显示出多态性的DNA指纹技术。因其操作简便、反应迅速、成本低和DNA用量少等优点而被广泛应用于药用植物种内或种间亲缘关系和遗传多样性方面的研究。RAPD反应对其Mg2+，dNTP，模板DNA，引物，Taq聚合酶等反应参数要求十分严格。只有通过优化试验来建立最佳反应体系，才能获得较为稳定而重复性的实验结果。本文对美花石斛RAPD-PCR反应体系中的Mg2+浓度，dNTP浓度，模板DNA浓度，引物浓度，Taq聚合酶量以及复性温度和反应次数进行优化，建立一个较为稳定而可靠的反应体系，为探索美花石斛遗传多样性分析奠定基础。
1 器材
1.1 材料实验材料采自于贵州省兴义市则戎乡野生美花石斛Dendrobium loddigesii Rolfe，由北京中医药大学阎玉凝教授鉴定。共选择5个个体，取同一个个体的幼嫩叶片5～6个，现场用变色硅胶及时干燥，回到实验室后，及时清洗，并存放于-70℃超低温冰箱，备用。
1.2 药品仪器CTAB，Tris，EDTA ，PVP(K30)（北京鼎国）；10×Taq酶配套缓冲液，dNTP，MgCl2，Taq酶和琼脂糖（广州威佳）；引物、B-巯基乙醇和1M TE（上海生工）等。DYY-2C三恒多用电泳仪和DYCP-31D琼脂糖水平电泳槽(北京六一仪器厂)；TGL-16G高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；金燕HH-S28S数显恒温水浴锅（金坛市大地自动化仪器厂）；Super-PCR基因扩增仪 (日本・株式会社フヱロ-テック)；超低温冰箱(SIM美国西蒙公司)；Image Master VDS凝胶成像系统（瑞士Ameisham Pharmacia Biotech）；Ultrospc 2000紫外/可见分光光度计（瑞士Ameisham Pharmacia Biotech）；移液器(日本三洋)等。
2 方法
2.1 基因组DNA的制备参照［6，7］并采用4×CTAB法制备模板DNA。分别称取低温保存的美花石斛干叶0.20 g，在研钵里研磨成粉末（加少量石英砂），于5 ml的离心管中，加1 ml 4×CTAB溶液（4% CTAB，0.1 mol・L-1 Triso-Cl pH 8.0，0.02 mol・L-1 EDTA pH8.0，1.4 mol・L-1 NaCl，3% PVP）混匀，冰上放置10 min，室温溶解，4℃ 8 000 r/min离心5min后弃上清液。在沉淀中加1.5 ml 65℃预热20 min的4×CTAB溶液（含20 μl β-ME），65℃水浴30 min（其间不时轻轻颠倒），取出后加入等体积的氯仿：异戊醇（24∶1），颠倒混匀5 min，4℃ 5 000 r/min离心5 min，吸取上清液（如果混浊，再抽提），加2倍体积的预冷无水乙醇，混匀后室温放置5 min，4℃ 10 000 r/min离心10 min，取沉淀，钩出DNA放在无菌的1.5 ml 离心管中，用预冷的70%乙醇洗2次，常温10 000 r/min离心2 min，把沉淀在超净台上干燥后用0.1×TE（10 mmol・L-1 Triso-Cl pH 8.0；1 mmol・L-1 EDTA pH 8.0）溶解DNA,4℃保存。
2.2 DNA样品的检测所提取的DNA，用Ultrospc 2000紫外/可见分光光度计，在260 nm波长下，测定样品DNA吸光度，计算样品DNA的浓度，浓度计算公式为：浓度（ng/μl）=50 ng・μl-1 ×A260×稀释倍数。另外，在A260与A280的比值计算样品DNA纯度。经检测样品DNA浓度为230 ng・μl-1 。另外，OD260 /OD280均在1.7～1.9之间，符合PCR对DNA纯度的要求。
2.3 RAPD反应体系主要因素用量筛选PCR反应在日本・株式会社フヱロ-テックSuper PCR仪上进行。RAPD-PCR反应体系的Mg2+，Taq 聚合酶，引物，模板DNA和dNTPs用量，以及复性温度和循环数等7个因素分别设置若干水平，并进行优化筛选。总反应体系为25 μl，随机引物使用S80(ACTTCGCCAC)和S90（AGGGCCGTCT）两种。PCR扩增程序为94℃预变性3min；94℃变性50 s；38℃退火1 min；72延伸2 min；40个循环；72延伸5 min后4℃保存。在25 μl PCR反应终产物中，吸取10 μl反应液与2 μl 6×加样缓冲液混合，在1.8%琼脂糖凝胶中电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，电泳电场强度为5V/cm，电泳结束后把凝胶浸泡在0.5 μg・μl-1 溴化乙锭(EB)溶液里，染色10～20 min，凝胶成像系统下观察拍照。
3 结果
3.1 Mg2+浓度对RAPD反应的影响 Mg2+浓度梯度为0.2，0.5，1.0，1.2，1.5，2.0，2.5，3.0 mmol・L-1，扩增结果。结果表明，Mg2+ 浓度低于0.5 mmol・L-1，高于2.5 mmol・L-1时无扩增条带出现，但是在0.5 ，1.5 mmol・L-1和2.5 mmol・L-1时，部分条带仍没有出现或有些模糊。Mg2+是Taq聚合酶实现聚合反应所必须的一种二价阳离子，选择合适的Mg2+浓度，对RAPD反应至关重要。一般PCR反应所使用的Mg2+浓度在0.2 ~2.5 mmol・L-1之间［8］。根据实验结果，Mg2+浓度确定为1.2 mmol・L-1。
3.2 Taq聚合酶浓度对RAPD反应的影响Taq聚合酶浓度共设置8个水平，分别是0.2，0.5，1.0，1.2，1.5，2.0，2.5和3.0 U。实验结果显示（图2），在25 μl反应体系中，Taq聚合酶浓度在1.2~2.0U之间效果较好。由于在RAPD反应中高浓度Taq聚合酶容易产生非特异扩增产物，过低会使影响合成效率，导致扩增产物减少。从经济角度和实验结果看，Taq聚合酶浓度1.2 U为合适。
3.3 引物浓度对RAPD反应的影响引物浓度同样设置8个水平，分别是0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7和0.8 mmol・L-1，扩增结果见图3。从扩增结果来看，引物浓度对RAPD反应的影响也较明显，浓度为0.1 mmol・L-1时无扩增条带，而且在0.4～0.8 mmol・L-1时条带均较弱，甚至有些条带没有出现。浓度只有在0.2～ 0.3 mmol・L-1时扩增效果较好，扩增条带数量多而清晰，经比较，引物浓度确定为0.3 mmol・L-1。
3.4 模板DNA用量对RAPD的影响模板DNA的用量水平设置为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4和1.6 μl，共11个梯度。从实验结果可见，模板DNA的用量对RAPD扩增反应结果的影响不大，除了1.6 μl时扩增带稍弱外，其余扩增条带均较稳定。鉴于样品使用量，模板DNA用量定为0.2 μl（46 ng）。
3.5 dNTPs对RAPD的影响dNTPs浓度梯度共8个，分别是40，80，120，160，200，240，280和320 mmol・L-1。扩增结果（图5）显示，当dNTPs浓度在120～240 mmol・L-1之间效果较好,而低于120 mmol・L-1和高于240 mmol・L-1时，则出现扩增条带不清晰或无扩增条带。许多研究证明，dNTPs浓度对PCR扩增影响较大，其浓度过高时，会与Mg2+ 螯合，抑制扩增反应或导致核苷酸错误参入。鉴于此，dNTPs浓度确定为160 mmol・L-1。
3.6 退火温度的影响退火温度对PCR的特异性十分关键,温度过高会使寡核苷酸引物不能与模板很好地复性，扩增效率非常低；温度过低，引物将产生非特异性产物。本试验共设定15个水平，分别是30.0℃（条带1,2），31.7℃（条带3,4），34.3℃（条带5,6），36.0℃（条带7,8）， 38.5℃（条带9,10），40.0℃（条带11,12,），41.7℃（条带13,14），43.2℃（条带15,16），45.5℃（条带17,18），48.4℃（条带19,20），51.7℃（条带21,22），54.6℃（条带23,24），56.8℃（条带25,26），58.4℃（条带27,28）和60.0℃（条带29,30）。实验结果表明（图6-a和6-b），40.0~45.5℃时扩增效果较好，其中退火温度40.0℃时，扩增条带更加清晰而稳定。故退火温度就确定为40.0℃。
3.7 循环次数的影响循环次数设置为35和40两个水平，选用引物为S80（ACTTCGCCAC）和S90（AGGGCCGTCT）。结果表明，循环次数为40时，扩增产物条带清晰，条带较多，故美花石斛基因组DNA RAPD-PCR反应中循环次数设置为40。
3.8 RAPD-PCR反应体系的稳定性检验为检验扩增效果，选用上述最佳实验结果，采用S98（GGCTCATGTG）引物，对美花石斛5个个体的基因组DNA进行RAPD扩增试验。结果表明，扩增条带清晰，稳定。因此，美花石斛RAPD-PCR最佳反应体系：总体积为25 μl，其中Mg2+ 1.2 mmol・L-1，Taq聚合酶1.2U，引物浓度0.3 m mol・L-1，模板DNA用量46 ng，dNTPs浓度160 mmol・L-1。PCR扩增程序为94℃预变性3 min；94℃变性50 s；40℃退火1 min；72℃延伸2 min，循环次数为40次，72℃延伸5 min。
4 讨论
4.1 美花石斛植物体内的多糖、生物碱和酚类等物质会影响模板DNA 的提取、纯化以及RAPD扩增效果。因此在提取模板DNA的过程，尽可能去除这些杂质，以保证其纯度。实验证明，含有3%PVP和巯基乙醇的 4×CTAB提取美花石斛基因组DNA的方法，能够有效去除上述干扰物质，获得纯度较高的模板DNA，并扩增出较为稳定而可靠的RAPD扩增条带。
4.2 张铭等［9］和丁颌等［10］对铁皮石斛进行RAPD-PCR分析与鉴别时，既然总体积相同，但是其中的反应条件差异较大，说明对同种植物来讲，可以采用不同的RAPD-PCR反应体系。王爱民等［11］对美花石斛RAPD分析时所用的Mg2+ 和引物浓度分别是2 mmol・L-1和2 mmol・L-1（总体积为20 μl），高于该反应体系中的用量。使用少量药品试剂，获得稳定而清晰的扩增效果，必然会节约客观的实验经费。
4.3 RAPD反应的影响因子较多，除了Mg2+，Taq 聚合酶和引物等因素外，提取分离DNA 的实验室环境也会影响实验效果。实践证明，在较为稳定的实验室环境中，采用上述反应体系，能够获得非常满意的PCR扩增效果。该反应体系是否适合于其他药用石斛基因组DNA的分子标记分析，还有待于进一步研究。
参考文献： ［1］ 李满飞,平田羲正,徐国钧,等. 粉花石斛化学成分研究［J］.药学学报,1991,26(4): 307. ［2］ 秦海林,张建新,王峥涛,等.环草石斛的1H-NMR指纹图谱解析［J］.中国中药杂志,2002,27(12):919. ［3］ 李满飞,徐国钧,平田义正,等.中药石斛类多糖的含量测定［J］.中草药,1990,21（10）:10. ［4］ J. G. K. Williams, A. R. Kubelik, K. J. Livak et al. DNA polymerphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers［J］.Nucleic Acid Res, 1990,18:6351. ［5］ J. Welsh, M. McCleuand. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers［J］.Nucleic Acid Res, 1990, 18:7213. ［6］ 顾红雅，礼 嘉.植物分子生物学实验手册［M］.北京：高等教育出版社，1998：5. ［7］ 彭 锐，宋洪元，李泉森，等. 石斛总DNA的提取及鉴定［J］.中国中药杂志，2003，28（12）：1129. ［8］ 夏 铭,栾非时,李景鹏.RAPD影响因素的研究及实验条件的优化进展［J］.植物研究，1999,9(2):195. ［9］ 张 铭，黄华荣，廖苏梅，等. 石斛属RAPD分析及鉴定铁皮石斛的特异性引物设计［J］.中国中药杂志，2001，26（12）：442. ［10］ 丁 颌，丁小余，沈 洁，等. 铁皮石斛野生居群遗传多样性的RAPD分析及鉴定［J］.药学学报，2005，40（11）：1028. ［11］ 王爱民，秀 申. 两种药用石斛RAPD反应的实验简报［J］.中药材，2002，25（5）：324.
