论文：石斛不同种、不同药用部位中多糖含量测定
论文：石斛不同种、不同药用部位中多糖含量测定
作者：孙卓然，刘圆，李晓云，刘超
【摘要】 目的测定不同种石斛及金钗石斛、马鞭石斛、叠鞘石斛、鼓槌石斛的不同药用部位中多糖的含量。方法采用紫外-可见分光光度法。结果不同种石斛茎中多糖含量为：球花石斛18.96 %，马鞭石斛24.89 %，金钗石斛20.49 %，报春石斛15.83 %，肿节石斛8.27 %，叠鞘石斛16.32 %，鼓槌石斛15.33 %，美花石斛28.28 %，兜唇石斛9.26 %；4种石斛不同药用部位多糖的含量：金钗石斛根15.36 %，茎20.49 %，叶22.30 %；马鞭石斛根17.56%，茎24.89 %，叶20.88 %；叠鞘石斛根9.48 %，茎16.32 %，叶17.42 %；鼓槌石斛根10.06 %，茎15.33 %，叶19.81 %。结论该实验方法简便、快速、准确。各种石斛及其根茎叶中多糖含量均比较高，从资源的综合和可持续利用的角度考虑，建议可以全草入药；美花石斛、球花石斛、报春石斛、叠鞘石斛、鼓槌石斛、肿节石斛茎在进行药效研究的提前下，确认是否可以替代当前《中国药典》品种入药。
【关键词】 石斛 多糖 紫外-可见分光光度法
Abstract：ObjectiveTo determine polysaccharide from several Herba Dendrobii and different medical parts of D. nobile Lindl, D. fimbriatum Hook, D. denneanum Kerr, and D. chrysotoxum Lindl.MethodsUV method was used.ResultsThe content of polysaccharides in different Herba Dendrobii was as follows: D. thyrsiflorum. Rchb.f of 18.96%, D.fimbriatum Hook of 24.89%, D. nobile Lindl of 20.49% , D. crepidatum Lindl of 15.83%, D. pendulum Roxb of 8.27%, D. denneanum Kerr of 16.32%, D. chrysotoxum Lindl of 15.33 %, D.loddigesii Rolfe of 28.28%, D．aphyllum (Roxb.)C. E. Fisch of 9.26%; the contents of polysaccharides from root, stem and leaf in D. nobile Lindl Lindl were 15.36% , 20.49% and 22.30%; In D.fimbriatum Hook were 17.56% , 24.89% , 20.88%; In D. denneanum Kerr were 9.48%, 16.32%, 17.42%; In D. chrysotoxum Lindl were 10.06%, 15.33%, 9.81%.ConclusionThis method is simple, sensitive and accurate. The content of polysaccharides is higher in leaves from different parts, and we should try to keep leaves when medicinal material is processed.
Key words： Dendrobium; Polysaccharide; UV
石斛属Dendrobium为兰科最大的属之一［1］, 全世界共有一千五百多种, 广泛分布于亚洲、欧洲及大洋洲等热带及亚热带地区。我国约有76种,主要分布于西南、华东及华南地区。石斛首先记载于《神农本草经》，并列为上品。《本草纲目》言：“俗方最以补虚，主治伤中，除痹下气，补五脏虚劳羸瘦，强阴益精；厚肠胃，补内绝不足，逐皮肤邪热痒气，治男子腰脚软弱，健阳，补肾益力，壮筋骨，暖水脏，轻身延年等”在我国传统医学中经历了2000年以上的应用历史。《中国药典》2005年版收载金钗石斛Dendrobium nobile Lindl、铁皮石斛Dendrobium candidum Wall.ex. Lindl、马鞭石斛Dendrobium fimbriatum Hook。石斛具有滋阴清热、益胃生津和润肺止咳等功效, 常用于治疗热病伤津、口干烦渴、病后虚热等多种病症［2］。现代药理研究证明石斛中多糖类成分是石斛具有免疫增强作用和抗肿瘤作用的活性成分 ［3，4］。 石斛为我国常用贵重药材,野生资源匮乏，而种植石斛规模较小，不能满足临床和新药开发的需要；而且民间药用石斛品种较复杂且规格不统一，它们能否替代药典品种入药，是迫切需要解决的问题。因此，本文对9种石斛茎中多糖、4种石斛的不同部位中多糖含量进行了测定， 以期能寻找到石斛新的药用资源和新的药用部位，为科学、合理和正确使用该类药材提供实验数据。
1 材料与仪器
1.1 仪器UV一752分光光度计(上海第三分析仪器厂)；SHB-3循环多用真空泵（郑州杜甫仪器厂）；hh-2数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；hctp11b5托盘天平（北京医用天平厂）；正德牌远红外可控调温电炉（成都市聚焱电器厂）；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
1.2 药材石斛药材收集于云南各地、四川夹江县歇马乡及成都五块石药材市场，所有药材均经刘圆教授鉴定。见表1。表1 不同品种石斛采集地点及日期（略）
2 方法与结果
2.1 多糖的提取与精制称取各石斛药材粉末（过2号筛）100 g，精密称定，分别至圆底烧瓶中，各加入石油醚（60～90℃) 400 ml，脱脂30 min，过滤，通风橱中挥去溶剂。滤渣以80 ％乙醇100 ml回流提取30 min，趁热过滤。滤渣用80 ％热乙醇充分洗涤，再于通风橱中挥去溶剂。取各残渣分别再用 500 ml蒸馏水回流2 h，提取3次，趁热过滤，用热水洗涤药渣和烧瓶，合并滤液。滤液浓缩至150 ml，加入等容积的 sevag试剂 (按正丁醇∶氯仿=4∶1配制而成)，分液漏斗萃取。取上层液体，反复操作。紫外分光光度计扫描，无蛋白吸收峰。逐滴加入乙醇(95％)至整个溶液中含醇量达到80％，滴加过程中用磁力搅拌器搅拌，静置过夜。抽滤，沉淀用无水乙醇反复洗涤，60℃真空干燥，得各石斛精制多糖，封装备用［5～7］。
2.2 对照品溶液的制备称取葡萄糖约0.08 g于小烧杯中，精密称定，用蒸馏水溶解后，移至100 ml棕色容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀，得对照品溶液。
2.3 标准曲线的制备精密取葡萄糖标准液1，1.5，2，2.5 ，3，3.5 ml，分别置50 ml棕色容量瓶中，各加蒸馏水至刻度。精密量取上述各浓度的标准溶液0.5 ml于10 ml棕色容量瓶中，各精密加入5 %苯酚溶液1.0 ml，摇匀，迅速加入5.0 ml浓硫酸，在沸水浴中加热20 min，冷却至室温。在波长490 nm下测定吸光度，同时做一空白，以标准溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。对所测数据采用回归法计算出标准曲线的回归方程为Y=4.994 9X－0.025 2（r=0.999 4）,结果表明在0.016 ～0.294 mg/ml之间，葡萄糖浓度与吸光度值具有良好的线性关系。
2.4 稳定性实验取葡萄糖标准液0.5 ml，置10 ml容量瓶中，按标准曲线制备项下的方法，自“加入5 %苯酚溶液1 ml”起，依法每隔0.5 h测定吸光度值，连续4 h，结果吸光度基本无变化，样品溶液的稳定性良好。
2.5 精密度实验精密量取葡萄糖标准溶液0.5 ml，置10 ml容量瓶中，按标准曲线制备项下的方法，自“加入5 %苯酚溶液1 ml”起，依法重复测定吸光度，RSD为1.06 %（n=6）。结果表明精密度良好。
2.6 加样回收率实验分别取相应石斛粉末各 0.25 g，分别精密加人葡萄糖储备液适量，按样品制备和含量测定方法测定，平均回收率 98.62 ％，RSD为 1.27 ％（n=9），符合测定要求。
2.7 换算因子的实验称取 6O ℃干燥至恒重的相应石斛多糖各10 mg，精密称定。分别配制成0.1 mg／ml溶液。各取 0.5 ml按标准曲线的制备方法，测定吸收度，另取葡萄糖标准液，同法操作，求出相应石斛中葡萄糖浓度，按下列公式计算换算因素11种石斛多糖换算因子。 f=多糖重量／(多糖液的葡萄糖浓度 ×多糖的稀释因素)
2.8 不同种、不同药用部位多糖的含量测定精密称取 60℃恒重的上述石斛茎粉末（过2号筛）各0.5 g,精密称定，分别置圆底烧瓶中，加入石油醚 (60～90℃)5.0 ml，脱脂30 min，过滤，通风橱中挥去溶剂。滤渣以80 ％乙醇100 ml回流提取30 min，趁热过滤。滤渣用80 ％热乙醇充分洗涤，再于通风橱中挥去溶剂。取残渣再用 100 ml蒸馏水回流2 h，提取3次，趁热过滤，用热水洗涤药渣和烧瓶，合并滤液，冷却后在500 ml量瓶中蒸馏水定容。精取各石斛提取液0.5 ml，按照标准曲线项下操作，测定吸收度，按下列公式计算样品中的多糖含量，重复 6次，取平均值。结果见表2，3。表2 不同种石斛茎中多糖的含量（略）表3 4种石斛不同部位的多糖含量（略） 多糖含量(％)=C×D×f×V/w C：样品溶液中葡萄糖浓度(μg/ml)；D：样品溶液的稀释因素；f：换算因素；V：样品溶液体积(ml)；W：样品溶液的重量(μg)
3 讨论 在所测的样品中，球花石斛中多糖含量和药典中所收载石斛品种含量接近，美花石斛中多糖的含量高于金钗石斛和马鞭石斛，因此从免疫增强作用和抗肿瘤作用的有效成分石斛多糖的角度考虑，在进行药效研究的前提下，确认美花石斛、球花石斛、报春石斛、叠鞘石斛、鼓槌石斛、肿节石斛茎是否可以替代当前药典品种入药。
石斛传统的入药部位是茎，但从本实验结果表明：根和叶的含量比较高，建议全草入药。由于药材采集样品不全的原因，没有对每一种均进行根、茎、叶多糖含量的测定，实验正在进行之中。 虽然不同种中石斛茎的多糖含量均较高，但还是有较大差异，提示各药材的品质有差异。又由于实验所采集样品多数为野生随机采样，不能准确地确定药材的生长年限，生态环境也不完全相同，故可考虑规范化种植后再用本方法对上述石斛进行平行比较研究，并得出更为准确、可靠的结论。
【参考文献】 ［1］白 音，包英华，金家兴，等.我国药用石斛资源调查研究［J］.中草药，2006，37（9）：附4. ［2］包雪生，顺庆生，张申洪，等.中国药用石斛图志［M］.上海：上海科学技术文献出版社，2005. ［3］张纪立，何锦丽.石斛药理研究进展［J］.时珍国医国药，2000，11（5）：469. ［4］郭 勇，程晓磊.石斛在恶性肿瘤治疗中的作用［J］.浙江中西医结合杂志，2007，17（7）：454. ［5］钱 叶，吕不望. 石斛中石斛多糖的提取工艺研究［J］.中国现代应用药学杂志，2005，22（4）：293. ［6］白 音，王文全，包英华，等. 不同产地美花石斛形态及多糖含量比较研究［J］.中药材，2007，30（2）：130. ［7］范俊安，王继生，张 艳，等. 铁皮石斛组培品与野生品的形态组织学和多糖含量比较研究［J］ .中国中药杂志，2005，30（21）：1648.
