不同光质和氮浓度对铁皮石斛组培苗的影响
项目可行性报告 不同光质和氮浓度对铁皮石斛组培苗的影响
一、立项的背景和意义。 铁皮石斛（Dendroium candidium Wall ex Lindl.）又名黑节草，属兰科石斛属植物 多年附生草本植物，生境较为独特，主要生长于适宜温度、高湿的阴坡、半阴坡微酸 性岩层峭壁及丛林树上或林下岩石上[1]，常群居分布，有林木遮阴。 铁皮石斛是我国传统名贵中药[2]。它的药用价值早在《本草纲目》中就又记载， 其主要有效成分是石斛碱、多糖等成分。
石斛多糖的药理作用主要表现在免疫，强壮， 抗衰老等方面；生物碱的药理作用主要表现在抗肿瘤，对心血管，胃肠道抑制作用及 止痛退热等作用。 《中华人民共和国药典》(化学工业出版社，2000)对药用石斛功能与 主治的描述为：益胃生津，滋阴清热，用于阴伤津亏，口干烦渴，食少干呕，病后虚 弱，目暗不明。现代药效研究证明，铁皮石斛具有增强人体免疫力、防止衰老、消除 肿瘤、抑制癌症、恢复嗓音、抗声带疲劳等作用[3,4]。 目前，国内外有关铁皮石斛研究和发展主要集中于其组织培养、化学成分、药理 作用、菌根真菌等方面的研究。
铁皮石斛是直接入药的一类中药，由于经济价值高， 采挖量大，加之生长环境要求苛刻，在自然环境下生存压力很大，指使野生资源面临 枯竭，已被列为国家重点保护的药材品种[5-7]。目前对此类植物的人工引种、栽培，在 某种意义上保护了种质资源[8]。不少研究的重点在于收集种质资源，培育出质量好、 产量高、抗病虫害能力强、易于栽培的新品种[9]。但是由于在自然条件下，铁皮石斛 授粉和结实率较低，因此种子的获得不仅受到季节的严格控制，而且相当困难，而且 在自然条件下其种子很难生长成植株。
在目前的研究中，一般通过建立离体快速繁殖 体系，大部分以铁皮石斛原球茎为外植体进行组织培养[10]，也有以种子作为外植体， 但取材比较困难。目前国内铁皮石斛生产量还远不能满足市场的需求，产品价格居高 不下。而另一方面，铁皮石斛栽培困难，产量低，最高鲜品产量三年仅为 600 至 800 公斤，远远低于其它一些中药材的产量。
有研究表明，环境因子变化或生长发育等因素可诱发其碳代谢途径的转变[11]，水 分对其生长发育也有影响[12,13]，这些外界因子均能影响铁皮石斛野外生长，也是导致 石斛野生资源匮乏的原因之一。因此，选用一种受外界环境因子影响较少的繁殖途径 是具有一定的现实意义的。植物组织培养具有繁殖快，周期短，受外界环境影响少等 特点，因此，选用组织培养的方法快速大量繁殖试管苗，是解决种苗的有效途径[14]。 已有研究表明，石斛组培苗在药用成分上与野外苗比较接近，甚至超过野外苗，并可 以代替野外苗入药[15] 。 光质对高等植物和藻类的碳水化合物和蛋白质代谢有调节作用。目前对光质的研 究主要应用于农作物领域，如番茄[16]，水稻，黄瓜[17]等，而未见有不同光质对石斛影 响的报道。对农作物的研究发现，在蓝光下生长的植物的蛋白质含量较高，而在红光 下生长的植物通常碳水化合物含量较高[18-21]。铁皮石斛有效成分的研究主要集中在多 糖和生物碱的研究上。
生物碱是作为一种在生物体中常见的而具有碱性的含氮有机化 合物，而多糖是细胞中碳水化合物的一种；因此，通过测定不同的光质条件下，铁皮 石斛中生物碱和多糖含量的变化，获取使铁皮石斛中生物碱和多糖含量增加的最佳的 光质，这对研究石斛类药材具有重要的理论意义和现实意义。 不同的光质对植物所起的作用是不同的，其中蓝光对硝酸还原酶(nitrate reductase, NR)的刺激作用很可能是直接的，因为 NR 的辅基有黄素（FAD）和喋呤[22]，而现在 认为蓝光受体的生色团就含有黄素和喋呤[23]。因此，蓝光对 NR 的激活作用可能会比 其他光质强[24]。植物生长发育所需要的氮素主要来自硝酸盐(N03-)同化。NR 是 N03还原过程第一步反应的催化酶，也是关键的限速酶，光和无机氮盐对其活性具有重要 的调节作用[25]，硝酸亚硝酸盐的还原是由亚硝酸还原酶（nitrite reductase，NiR）催化。 并且植物氮素营养状况的好坏，直接影响光合速率和生长发育，并最终影响植物的产 量和光能利用率。
在一定范围内，光合速率与叶片含氮量成直线相关[26]。因此，不同 光质处理结合氮素营养分析药用植物的生长和药用成分的积累， 能够较好地指导生产， 并在理论上有所创新和发展。 本研究主要针对铁皮石斛野外产量不高，药用成分不稳定等缺陷，采用组织培养 方式进行繁殖，并借鉴利用不同光质和氮浓度能提高农作物含氮物质和碳水化合物含 量技术，对铁皮石斛进行光质和氮浓度的处理。通过测定其中硝酸还原酶和亚硝酸还 原酶的活性变化，了解铁皮石斛对氮的吸收和利用情况，探索铁皮石斛对氮的吸收机 理，从而提高铁皮石斛的生长速率。同时，通过比较其药用成份与对照组的差异，来 确定生物碱和多糖含量最高的培养条件。浙江是目前国内铁皮石斛产业化程度最高的 地方,也是生产企业最集中的省份，铁皮石斛的人工栽培，一直被誉为药学上的“歌德 巴赫猜想” ，因此，本研究不仅可以解决石斛材料短缺等问题，而且可以指导应用于野 生栽培实践，同时也支持了省有关部门从源头上规范铁皮石斛产业的政策，对其产业 化生产有重要的意义。
而就国内外研究现状和发展趋势来看： 为了加强对其野生资源的保护和合理利用，国内外学者对石斛属植物进行了大量 研究，特别是在石斛的组织培养及综合开发利用方面做了许多卓有成效的工作[25]。 铁皮石斛的组织培养研究在我国已有 20 多年， 在快速繁殖和扩大繁殖系数等方面 已经取得了一定的进展。 1997 年，浙江森宇公司投资 500 万元创办义乌市铁皮石斛研究所，与浙江大学、 浙江师范大学、上海中药研究所等科研院校合作，开始野生铁皮石斛人工组织培养高 产栽培研究与综合开发，2001 年，这一项目被列为国家“十五”科技攻关项目，开创 了民营企业承担国家级科技项目的先河。并大大地提高试管苗移栽成活率，对该产业 的发展具有非常重要的意义。
目前，国内石斛的快速繁殖技术已较为成熟，有能力提供大量野外栽培用苗，可 以基本解决石斛商品苗的供应问题。但是石斛组培技术也存在着一些问题，如：石斛 组培技术要求较高，操作严格，价格较高；石斛试管苗出瓶后的成活率低，生长缓慢， 苗期的管理十分困难，易受病虫害侵袭等。 因此，利用铁皮石斛组织培养系统，进行不同光质处理结合氮素营养综合研究铁 皮石斛生长发育和药用成分的积累，提高其生长速率和有效成分。既可以直接用于生 产铁皮石斛制品的生产，也可能指导铁皮石斛的野外田间栽培，提高其产量和质量， 以满足不断扩大的市场需求，提高经济效益。
二、项目主要研究开发（产品开发）内容、技术关键以及科技创新的主要方式。 主要研究开发（产品开发）内容： 对不同发育时期的组培苗或原球茎进行不同光质（白光、红光，蓝光）和不同氮 形态（氨态氮、硝态氮）及其不同浓度处理，设计不同的处理时间，对其实验材料的 生长指标（产量、株高、叶面积、根系分析、折干率等） 、酶活性（硝酸酶、亚硝酸 酶）以及药用成分等含量进行测定。最后筛选出最佳的栽培条件，并用于指导产业化 实践。
技术关键： 1、不同光质和不同氮形态（氨态氮、硝态氮）及其不同浓度交互处理，并进行统计 分析； 2、用 HPLC 测定生物碱和多糖含量。 科研创新主要方式： 利用目前应用于提高农作物产量的技术： 通过改变光质来提高石斛的产量和质量， 如碳水化合物，含氮物质等。石斛的主要药用成分为多糖（碳水化合物） ，生物碱（含 氮物质） ，故本实验借鉴于该技术应用于药用植物的产量提高，并结合不同氮浓度， 通过对氮代谢途径的主要酶物质的变化，以期找到最佳的培养方式。因此，我们在设 计思路有所创新，既能直接用于生产，又能指导野外田间栽培，也能探索不同光质和 植物对氮元素利用的交互机理，在理论上将有所突破。
三、项目预期目标（主要技术经济指标、应用前景、获奖资助知识产权等情况） 。 主要技术经济指标：预计研究取得的成果，能使铁皮石斛栽培生产增产 10%至 20%，增 加药用成分 5%至 10%，年增产 100 万元，年增税金 10 万元，年增 利润 50 万元。 应用前景：确定不同光质和氮浓度对铁皮石斛的作用，寻求对其生长有利的条件，实现 铁皮石斛快速大量繁殖，进行工厂化生产铁皮石斛，提高经济效益，并且可 以指导铁皮石斛的野外栽培。 获奖资助知识产权的情况：发表论文一至两篇，争取申请专利一项。
四、项目实施方案
1 前期准备： 通过查阅文献、收集资料，对铁皮石斛的相关知识、研究进展等有了全面地了解 和把握。且本实验室通过多年的铁皮石斛组织培养和野外栽培，及其药用成分分析和 生长指标的测定，对实验流程及仪器的使用有了全面地了解，具备了一定的实验操作 能力。也为本研究奠定的物质基础。实验所需的器材：培养箱、组培室、纯净操作台、 灭菌锅及药用成分分析的仪器等已经具备，铁皮石斛原球茎和组培苗已在培养过程 中，这对课题的顺利开展提供了保障。 项目组成员分工明确，组员团结合作，认真负责，科研态度严谨，对科研有很 高的热情，相信能顺利出色地完成该课题。同时指导老师具有丰富的理论知识和较高 的科研能力,也为我们更好地进行课题研究提供了保障。
2 材料准备： 以同一批铁皮石斛种子为外植体，在一定的培养基上进行培养，大量繁殖原球茎 后，转接到另一种培养基上生长。现已培养出 500 瓶原球茎和 500 瓶小苗，为完成本 课题准备了足够的实验材料。
3 进行不同的光质和氮源及浓度的处理 当铁皮石斛组培苗进行不同的光质和氮源及浓度的处理， 培养基上的氮含量分别 为原来的 1/4、1/2 和 2 倍及其对照处理(原来的浓度)，不同光质采用红光、蓝光，以 白光作为对照处理。实验采用二因素交叉处理。
4 各种指标的测定 每隔一段时间，记录不同处理下铁皮石斛的生长指标（生物量，株高，叶面积， 根系分析，折干率等） ，同时进行下列指标的测定： 4.1 多糖含量测定； 4.2 生物碱含量测定； 4.3 硝酸酶含量测定； 4.4 亚硝酸酶含量测定。
五、计划进度安排 计划实验在 2007-09-01 到 2008-09-01 内完成， 基本上分为三个阶段： 2007-09-01 到 2008-02-01：大量繁殖铁皮石斛的原球茎和组培苗； 2008-02-01 到 2008-05-15：对铁皮石斛的原球茎和组培苗进行不同光质和氮浓度的处 理； 2008-05-15 到 2008-06-20：定期观察石斛的生长情况（产量、株高、叶面积、根系分 析、折干率等） ，测定其生物碱、多糖、硝酸还原酶、亚 硝酸还原酶等含量。
六、经费预算 项目经费总计 0.8 万元 向省科技厅申请 0.8 万元。 经费类别 材料费 金额数（单位：万元） 用途 0.4 铁皮石斛种子的购买，组织培养药品、 器皿等。滤光膜、含量测定玻璃器皿、 药品试剂费等 高压灭菌、无菌操作台、测定生理生化 和药用成分的仪器所耗的燃料动力费 资料打印费，发表论文、申请专利所需 的资金，版面费、信息交流费等
