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论文:美花石斛种质资源的RAPD分子鉴定_石斛论文_石斛研究

2020-03-14 08:37:57 0
论文:美花石斛种质资源的RAPD分子鉴定 作者:包英华 白音 王文全 阎玉凝 【摘要】 目的采用RAPD分子标记技术对不同产地美花石

论文:美花石斛种质资源的RAPD分子鉴定

作者:包英华 白音 王文全 阎玉凝

【摘要】  目的采用RAPD分子标记技术对不同产地美花石斛进行分析,为美花石斛种质资源的准确鉴别提供依据。方法用RAPD分子标记技术对不同产地美花石斛基因组总DNA进行PCR扩增,根据其扩增产物分子量大小进行编码计算。结果从117种随机引物筛选出8种有效引物,S2108的PCR扩增产物中的特异性位点能够鉴别出广西玉林居群和贵州安居群。结论利用RAPD分子标记技术鉴别美花石斛种质资源是可行的,在严格控制各项条件下能够保证鉴别美花石斛种质资源的稳定性和重复性。

【关键词】  美花石斛; 种质资源; RAPD; 分子鉴定  

Abstract:ObjectiveTo authenticate the germplasm resources of Dendrobium loddigesii collected from different areas by RAPD. Methods The total DNA of D. loddigesii was amplified by RAPD-PCR, and the amplified DNA were investigated based on their molecular weight and amplifying distances. Results 8 effective primers were selected from 117 random primers. Some polymormic loci amplified from primer S2108 could effectively identify Yulin population and Anlong population of D. loddigesii.Conclusion It is feasible for identifying germplasm resources of Dendrobium loddigesii using RAPD molecular marker, and the stability and repeatability of identification results can be insured under the strict and normative experiment processes in RAPD.  

Key words:Dendrobium loddigesii;  Germplasm resources;  RAPD;  Molecular authentication  

美花石斛Dendrobium loddigesii Rolfe为兰科石斛属多年生草本植物,别名为环草石斛、粉花石斛或耳环石斛等。美花石斛主要分布于贵州、广西、云南和广东等地区,是我国常用名贵中药材,具有滋阴清热、益胃生津和润肺止咳等功效,主要含有多糖、生物碱和Stilbenoids类等化学成分[1~3]。  

由于美花石斛种子在自然条件下萌发率极低,再加上长期过度采收,导致野生美花石斛种质资源急剧减少,甚至难以找到较为完整的野生居群。于1987年出台的《国家重点保护野生药材物种名录》中,美花石斛(环草石斛)被列入国家三级珍稀濒危保护植物。自从2004年以来,课题组成员对云南、贵州、广西和广东等省区的美花石斛种质资源进行多次考察,发现不同产地美花石斛形态特征具有一定的差异,然而这些外部形态特征受环境因素的影响较大,容易产生变异,因此仅仅依靠外观特征,很难准确鉴别出其原植物。    随着分子生物学的快速发展,生物技术和方法不断得到完善,同时也促进了相关学科的发展步伐。如DNA分子标记技术和方法广泛应用于中药材鉴定领域,取得了许多令人可喜的成绩。RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)是1990年由J.G.Williams等[4]和J.Welsh等[5]推出的一种分子标记技术,是以PCR反应为基础,以随机碱基寡核苷酸为引物,对基因组DNA进行扩增而显示出多态性的DNA指纹技术。因其操作简便、反应迅速、成本低和DNA用量少等优点而被广泛应用于多种中药材的鉴别上,但美花石斛种质资源的RAPD分子鉴别方面的研究报道尚未见到。本文利用RAPD分子标记技术对不同产地美花石斛种质资源进行分析,为美花石斛种质资源的准确鉴别提供理论依据。  

1  材料与方法  

1.1  材料  

实验材料采自贵州、云南和广西等地区的野生美花石斛(表1),由北京中医药大学阎玉凝教授鉴定。取幼嫩叶片8~10片,用变色硅胶干燥,存放于-70℃SIM型超低温冰箱(美国西蒙公司),备用。表1  用于RAPD分析的不同居群美花石斛样品(略)  

1.2  基因组DNA的提取和检测    

采用改进的4×CTAB法,制备模板DNA。称取低温保存的不同居群美花石斛叶片0.20g,研磨后放入5 ml离心管中,加1 ml 4×CTAB溶液,混匀,4℃ 8 000 r/min离心5 min,弃上清液。在沉淀中加65℃预热的1.5 ml 4×CTAB溶液,65℃水浴30 min,加等体积的氯仿:异戊醇(24∶1),混匀5 min,4℃ 5 000 r/min离心5 min,吸取上清液,加无水乙醇,4℃ 10 000 r/min离心10 min,沉淀用70%乙醇清洗,干燥,用0.1×TE溶解,4℃保存。    精密吸取20μl基因组DNA溶液,稀释至2 ml,用Ultrospc 2000紫外/可见分光光度计,测定紫外吸光度,计算其浓度和纯度。检测结果显示,DNA浓度和纯度分别为50 ng·μl-1和1.7~1.9,符合PCR扩增要求。  

1.3  引物筛选实验所用引物共117条(购自上海生工,S80~200,S1001~1020,S1341~S1360和S2101~2160)。以贵州兴义居群为模板,对引物进行筛选,获得50个具有扩增条带的引物,在此基础上,进一步筛选出扩增条带多而清晰的8种引物,用于分析美花石斛种质资源的RAPD分析。    

1.4  PCR反应体系及产物检测 PCR反应总体积为25 μl,其中10×Buffer 2.5 μl,Mg2+ 1.2 m mol·L-1,dNTPs 160 m mol·L-1,模板DNA用量40 ng,Taq聚合酶1.2U,随机引物0.3 mmol·L-1,ddH2O 16.2μl。扩增程序为94 ℃预变性3 min,94 ℃变性50 s,40 ℃复性1 min,72 ℃延伸2 min,循环40次,最后72 ℃延伸5 min。反应产物以100~3 000 bp ladder为分子量标记,1.8%的琼脂糖凝胶电泳,EB染色20 min。采用Image Master VDS凝胶成像系统(瑞士Ameisham Pharmacia Biotech)观察记录。每个随机引物重复扩增3次,选取重复性和稳定性好的扩增结果用于统计分析。    

1.5  数据统计根据PCR扩增条带在琼脂糖凝胶上的迁移程度,确定各居群RAPD-PCR条带的位置和分子量大小。在某一个位点上, 有条带的样品记为“1”, 无条带记为“0”,所得的位点编码按分子量大小排列。  

2  结果  

2.1  RAPD随机引物的筛选随机引物筛选结果显示,在117种随机引物中,多数引物所扩增的条带不清晰,甚至有些引物几乎不能扩增出任何条带。经多次重复筛选, 只有8种(S90,S107,S1001,S1016,S1349,S2108,S2117和S2143)引物能够扩增出重复性较好、条带清晰,而且多态性丰富的条带。因此,采用该8种引物,对美花石斛8个居群进行PCR扩增和分析。  

2.2  RAPD分子鉴别从8种随机引物的PCR扩增效果来看,S2108随机引物扩增条带较清晰,重复性较好(图1)。根据分子量大小,对所有条带进行编码(表2),结果显示所有条带共占据10个位点,其中2个位点是共性位点,其余位点是多态性位点。每个居群的编号序列不存在重复现象,而且每个居群均有特异性条带(表2)。由此来看,S2108随机引物能够较好地鉴别美花石斛8个居群。比如广西玉林居群 (Dlod07)就有2个特异性位点,分别在600bp和900bp附近;贵州安龙居群(Dlod05)有1个特异性位点,约在520bp处。表2  引物S2108对美花石斛8个居群扩增位点的编号(略)  

3  讨论  

RAPD分子标记因操作简便,成本较低、扩增数量较多等特点,被广泛用于药用植物品种鉴别上,如利用RAPD标记技术和方法成功鉴别了人参[6]、黄芩[7]、巴戟天[8]和红景天属植物[9]等中药材品种。但是,RAPD分子标记也存在重复性和稳定性较差等问题。笔者在实验过程中发现,只要严格控制实验室条件和尽量避免外界环境的干扰因素以及规范实验操作步骤,能够得到较为满意的结果。  

DNA分子鉴别技术和方法,对那些利用传统鉴别方法难以鉴别的中药材,无疑是优先选用的技术和方法。石斛为在《中国药典》收载的品种中,其原植物最为混乱的中药品种之一,利用DNA分子标记技术,成功鉴别了齿瓣石斛[10]、兜唇石斛[11]和束花石斛[12]的DNA分子鉴别。本文研究结果显示,S2108引物对美花石斛8个居群的鉴别具有很好的应用价值。今后在现有研究基础上,对不同居群美花石斛特异性条带进行深入分析,构建其特异性引物,以提高分子鉴定方法的准确性和稳定性。

 

 

【参考文献】    [1]李满飞,平田义正,徐国钧,等. 粉花石斛化学成分研究[J]. 药学学报,1991,26(4): 307.  [2]秦海林,张建新,王峥涛,等. 环草石斛的1H-NMR指纹普图解析[J]. 中国中药杂志,2002,27(12):919.  [3]李满飞,徐国钧,平田义正,等.中药石斛类多糖的含量测定[J].中草药,1990,21(10):10.  [4]J. G. K. Williams, A. R. Kubelik, K. J. Livak et al. DNA polymerphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J]. Nucleic Acid Res, 1990,18:6351.  [5]J. Welsh, M. McCleuand. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers[J]. Nucleic Acid Res, 1990, 18:7213.  [6]邵爱娟,李欣,黄璐琦,等. 用RAPD 技术对人参栽培群体的遗传分析[J]. 中国中药杂志,2004,29(11): 1033.  [7]邵爱娟, 李 欣, 黄璐琦,等. 不同种源黄芩的RAPD分析[J]. 中国中药杂志,2006,31(6):452.  [8]丁 平, 徐吉银, 楚桐丽. 巴戟天不同农家类型种质资源的RAPD分析[J]. 中药材,2006,29( 1):1.  [9]胡挺松, 陆一鸣, 马兰青,等. 红景天属4 种植物RAPD分析与分类鉴定[J].中草药,2005,35(11):1286.  [10]丁小余, 徐璐珊, 王峥涛, 等. 齿瓣石斛的位点特异性PCR鉴别[J]. 药学学报,2002, 37( 11) :897.  [11]丁小余, 徐璐珊, 常 俊, 等. 兜唇石斛的位点特异性PCR鉴别[J]. 南京师大学报(自然科学版),2002,25(4) :71.  [12]丁小余, 徐璐珊, 王峥涛, 等. 束花石斛及其相似种的DNA分子鉴别[J]. 中国中药杂志,2002,27(6 ):407.