石斛多糖的总含量测定
石斛多糖的总含量测定材料、仪器与试药
1.1材料 迭鞘石斛药材于2007年5月购于四川夹江县华头镇，经成都中医药大学中药鉴定教研室陈新副教授鉴定其为兰科迭鞘石斛Dendrobium denneanum Kerr.的干燥根。
1.2仪器与试剂 Uv-1100紫外-可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）；BP121S电子分析天平（万分之一）（德国sartorius公司）；BP211D电子分析天平（十万分之一）（德国sartorius公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；R-21型旋转仪（上海申胜生物科技有限公司）；苯酚，浓硫酸、乙醇等均为分析纯（成都科龙化工试剂厂）方法与结果溶液的制备
2.1.1对照品溶液的制备 精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品10.30mg。置100ml容量瓶中加适量蒸馏水溶解，稀释至刻度，摇匀，即得（没1ml含葡萄糖0.1030mg）
2.1.2 供试品溶液的制备 取迭鞘石斛粗粉2.5g，精密称定，置于圆底瓶中，加80%乙醇100ml回流提取1小时，趁热过滤，药渣挥干，加蒸馏水85ml，回流1小时，趁热过滤，用5吗；热水洗烧瓶和药渣3次，待冷却后移入250ml容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀，即得。
2.1.3苯酚显色液的制备 将50ml浓硫酸缓缓加入10ml水中冷却至室温，加0.6g苯酚晶体搅拌至溶解，即得。
2.2 迭鞘石斛多糖的精制 取迭鞘石斛粗粉50g，加石油醚250ml，回流提取1小时脱脂，过滤，挥干溶剂，以80%乙醇回流提取1小时，趁热过滤，挥干溶剂，加入500ml蒸馏水回流提取2次，没1小时一次，减压浓缩至150ml，用0.1%的活性炭脱色，过滤，加入95%乙醇是溶液含醇80%，静止过夜，沉淀物依次用无水乙醇，丙酮洗涤，60℃减压干燥，制得灰白色粉末状迭鞘石斛多糖。
2.3最大吸收波长的选择
分别精密称吸取供试品溶液0.5ml、对照品1.0ml分别置于具塞试管中，加水至2ml，再加显色剂5.0ml，摇匀，放置5min，置于沸水浴中加热30min后，取出，迅速冷却至室温，。另取2.0ml水做同上平行操作，做空白对照，在400~600nm，之间扫描。结果表明，对照品溶液和供试品溶液在490nm处有最大吸收峰，故选择490nm作为测定波长。2.4标准曲线的制备
精密移取对照品溶液0.1ml、0.2 ml、0.4 ml、0.8 ml、1.0 ml分别置具塞试管中，按照“2.3”项下的方法，自“加水至20ml”起操作。另取2.0ml蒸馏水同法操作，做空白对照，在490nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线经计算得回归方程A=0.0506C+0.0631，相关系数r=0.9995.结果表明，葡萄糖浓度在1.47~14.7ug/ml范围内，线性关系良好，结果见图2.5显色稳定性试验
取葡萄糖标准溶液1.0ml。按“2.3”项下操作显色，在不同的时间点测定其吸光度。结果表明，显色在4小时内稳定性良好，结果见表1 2.6换算因素的测定
精密称取60℃干燥至恒重的迭鞘石斛多糖50.87mg置于100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即可。精密吸取0.5ml，按照“2.3”项方法，自“加水至2ml”起操作，另取2.0ml水为空白，在490nm处测定吸光度。另精密去葡萄糖对照品0.8ml，，同法作测定吸光度。按照下面公式换算因素f=(w*1000)/C*D(其中W：称取多糖的重量（mg）C：溶液中单糖的浓度（ug/ml）；D：稀释因素。即稀释后总体积)。2.7 精密度试验
精密吸取对照品溶液1.0ml, 按照“2.3”项方法，自“加水至2ml”起操作，在490nm处测定吸光度,连续测定6次，其RSD=0.73%,表明仪器精密度良好，结果见表22.8 加样回收率实验
取已知含量的迭鞘石斛药材6份，每份0.1g，精密测定，分别精密加入石斛多糖17mg，按样品测定方法，计算，结果见表3.
2.9样品的测定
取各批迭鞘石斛药材样品（见表4）粉末各2.5g，精密称定，按照“2.1“项下供试品溶液的制备样品溶液。精密吸取各样品溶液0.5ml，按照“2.3”项方法，自“加水至2ml”起操作，另取2.0ml水为空白，在490nm处测定吸光度。另精密吸取葡萄糖对照品溶液0.5ml，同法操作，测定吸光度。按照下面公式计算样品中石斛多糖的含量：
多糖含量（%）=（C*D*f*10-6）/W*100% (其中C：样品提取液中按标准曲线计算出的单糖浓度（ug/ml）;D:稀释因素，即稀释后的总体积；f：换算因素；W：样品重量（g）)3讨论
3.1本文用改进后的浓硫酸-苯酚法对多糖含量进行测定，传统的硫酸-苯酚法的操作是：加5%苯酚溶液后，再加浓硫酸，振荡显色，加入浓硫酸时，系统显色温度相差较大，而造成相应的偶然偏差。而改进后的方法，由于先把水和硫酸混合，对浓硫酸起到了稀释作用，待冷却最后加入苯酚晶体，配成显色液，通过沸水浴加热来使其显色，保证了系统温度一致，很好解决了检测重现性与准确性。
3.2实验过程中，仅收集了四批迭鞘石斛药材药材，还需进一步扩大样本量，才能全面反映各地药材的质量信息。本研究为迭鞘石斛药材的质量评估提供依据，为其进一步开发利用打下基础。
参考文献《中国药典》（2005年版）《迭鞘石斛中总多糖的含量测定》 刘友平 张玲 李惠勇，范倩娴等（成都中医药大学 四川成都 610075）
