石斛论文：迭鞘石斛中总多糖的含量测定
石斛论文：迭鞘石斛中总多糖的含量测定
李旻 刘友平 张玲 李惠勇 范婧娴（成都中医药大学 四川成都 610075）
摘要：
目的 测定迭鞘石斛中多糖的含量。
方法 采用改良后的苯酚-硫酸比色法对迭鞘石斛中总多糖含量进行测定。
结果 石斛多糖经苯酚-硫酸法显色后在波长490nm处有最大吸收。本法准确，精密度高，葡萄糖浓度在1.47～14.7μg·ml-1（r=0.9995）范围内，线性关系良好，平均回收率为98.6%，RSD为1.15%。
结论 该法可作为迭鞘石斛质量控制的一种方法。
关键词：迭鞘石斛；苯酚-硫酸法；多糖Determination of Polysaccharide in Dendrobium denneanum Kerr.LI Min, LIU You-ping, ZHANG Ling,LI Hui-yong, FANG Jing-xian(Chengdu University of TCM, chengdu 610075, China)Abstract: Object: To determine the contents of Polysaccharide in D. denneanum Kerr. Methods: Contents of Polysaccharide is determined by Phenylhydrate-sulfuric acid method. Results: The maximum absorption wavelength was 490nm.Linear range was 1.47~14.7μg·ml-1（r=0.9995）.The average recovery rate was 98.6% and RSD was 1.15%. Conclusion:The method used in this paper simple.It can be used for determination of Polysaccharide in D. denneanum Kerr.Key words: D. denneanum Kerr.，Phenylhydrate-Sulfuric acid Method，Polysaccharide
石斛为常用名贵中药，具有益胃生津、滋阴清热之功效，用于热病伤津、口干烦渴、病后虚热、目暗不明等多种病症[1]。现代药理学研究表明，石斛具有抗肿瘤、增强人体免疫力、降血糖、抗氧化、抗衰老和抗血栓等作用。迭鞘石斛（Dendrobium denneanum Kerr.）为兰科石斛属植物，是中药石斛的来源之一，主要分布于我国四川、云南、广西等地，资源丰富，且易于人工栽培，目前在四川的乐山、雅安、洪雅等地已广泛栽培，并已作为商品药材广泛流通于市场。研究表现，迭鞘石斛中多糖类成分是其具有免疫增强和抗肿瘤作用的活性成分，为完善药材质量评价方法及提高药材的质量标准，本文采用苯酚-硫酸比色法[2]，对迭鞘石斛中的石斛总多糖进行定量分析测定，为迭鞘石斛药材的质量评价提供依据。
1. 材料、仪器与试药
1.1 材料迭鞘石斛药材于2007年5月自购于四川省夹江县华头镇，经成都中医药大学中药鉴定教研室陈新副教授鉴定其为兰科植物迭鞘石斛Dendrobium denneanum Kerr.的干燥茎。
1.2 仪器与试药UV-1100紫外-可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）；BP121S电子分析天平（万分之一）（德国Sartorius公司）；BP211D电子分析天平（十万分之一）（德国Sartorius公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；R-21型旋转蒸发仪（上海申胜生物科技有限公司）；苯酚、浓硫酸、乙醇等均为分析纯（成都科龙化工试剂厂）。
2. 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备精密称取 105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品10.30mg，置 100ml容量瓶中加适量蒸馏水溶解，稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml含葡萄糖0.1030mg）。
2.1.2 供试品溶液的制备取迭鞘石斛粗粉2.5g，精密称定，置于圆底瓶中，加80%乙醇100ml回流提取1小时，趁热过滤，药渣挥干，加蒸馏水85ml，回流1小时，趁热过滤，用5ml热水洗涤烧瓶和药渣3次，待冷却后移入250ml容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀，即得。
2.1.3 苯酚显色液的制备将50ml浓硫酸缓缓加入10ml水中冷却至室温，加入0.6g苯酚晶体搅拌使其溶解，即得。
2.2 迭鞘石斛多糖的精制取迭鞘石斛粗粉50g，加入石油醚（60～90℃）250ml，回流提取1小时脱脂，过滤，挥干溶剂，以80%乙醇回流提取1小时，趁热过滤，挥干溶剂，加入蒸馏水500ml回流提取2次，每次1小时，减压浓缩至150ml，用0.1%的活性炭脱色，过滤，加入95%乙醇使溶液含醇80%，静置过夜，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，60℃减压干燥，制得灰白色粉末状迭鞘石斛多糖。
2.3 最大吸收波长的选择分别精密称吸取供试品溶液0.5ml、对照品溶液1.0ml分别置具塞试管中，加水至2ml，再加显色液5.0ml，摇匀，放置5分钟，置沸水浴中加热30分钟后，取出，迅速冷却到室温。另取2.0ml水作同上平行操作，作为空白对照，在400～600nm之间扫描。结果表明，对照品溶液和供试品溶液在490nm处有最大吸收峰，故选择490nm作为测定波长。
2.4 标准曲线的制备精密移取对照品溶液0.1ml、0.2 ml、0.4 ml、0.8 ml、1.0ml分别置具塞试管中，按照“2.3.”项下方法，自“加水至2ml”起操作，另取2.0ml蒸馏水同法操作，作为空白对照，在490nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。经计算得回归方程为A=0.0506C+0.0631，相关系数r=0.9995。结果表明，葡萄糖浓度在1.47～14.7μg·ml-1范围内，线性关系良好。
2.5 显色稳定性试验取葡萄糖标准溶液1.0ml，按“2.3”项下操作显色，在不同时间点测定其吸光度。结果表明，显色在4小时内稳定性良好，结果见表1。表1 稳定性试验结果Tab.1 Stability Test resultsT（h）00.51.02.03.04.0RSD(%)A0.5130.5070.5120.5100.5150.5160.65
2.6 换算因素的测定精密称取60℃干燥至恒重的迭鞘石斛多糖50.87mg置于100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即可。精密吸取0.5ml，按照“2.3.”项下方法，自“加水至2ml”起操作，另取2.0ml水为空白，在490nm处测定吸光度。另精密吸取葡萄糖对照品溶液0.8ml，同法操作，测定吸光度。按照下面公式计算换算因素f=（W*1000）/C*D（其中W：称取多糖的重量（mg）；C：溶液中单糖的浓度（μg·ml-1）；D：稀释因素，即稀释后的总体积）。
2.7 精密度试验精密吸取对照品溶液1.0ml，照“2.3.”项下方法，自“加水至2ml”起操作，在490nm处测定吸光度，连续测定6次，其RSD=0.73%，表明仪器精密度良好，结果见表2。表2 精密度试验结果Tab.2 Precision Test resultsN123456RSD(%)A0.5060.5120.5070.5100.5080.5160.73
2.8 加样回收率试验取已知含量的迭鞘石斛药材6份，每份约0.1g，精密称定，分别精密加入石斛多糖17mg，按样品测定方法测定，计算，结果见表3。表3 加样回收试验结果Tab.3 Average recovery of Polysaccharide SamplesContent/mgAdded/mgFound/mgRecovery /%Average recovery/%RSD/%117.5117.4334.4598.6 98.6 1.15216.1516.5432.5199.5317.3417.3833.7497.2418.0217.8235.95100.3516.4916.3632.2798.2618.3618.1135.6897.8
2.9 样品的测定 取各批迭鞘石斛药材样品（见表4）粉末各2.5g，精密称定，按照“2.1”项下供试品溶液制备方法制备样品溶液。精密吸取各样品溶液0.5ml，按照“2.3”项下方法，自“加水至2ml”起操作，另取2.0ml水为空白，在490nm处测定吸光度。另精密吸取葡萄糖对照品溶液0.5ml，同法操作，测定吸光度。按照下面公式计算各样品中石斛多糖的含量：多糖含量（%）=（C*D*f*10-6）/W *100%（其中C：样品提取液中按标准曲线计算出的单糖浓度（μg·ml-1）；D：稀释因素，即稀释后的总体积；f：换算因素；W：样品重量（g）。）表4 不同批次药材中石斛多糖含量测定结果（n=3）Tab.4 Results of determination of samples（n=3）SamplesContent/%117.21216.51316.12417.51
4批药材中石斛多糖含量在16.12～17.51%之间。
3. 讨论
3.1 本文采用改进后的硫酸-苯酚法对多糖含量进行测定，传统的硫酸-苯酚法的操作是：加5%苯酚溶液后，再加入浓硫酸，振荡显色，加入浓硫酸时，系统显色温度相差较大，而造成相应的偶然偏差。而改进后的方法，由于先把水和硫酸混合，对浓硫酸起到了稀释作用，待冷却最后加入苯酚晶体，配成显色液，通过沸水浴加热来使其显色，保证了反应系统温度一致，很好地解决了检测的重现性与准确度。
3.2 实验过程中，仅收集到4批迭鞘石斛药材，还需进一步扩大样本量，才能全面反映各地药材的质量信息。本研究为迭鞘石斛药材的质量评价提供依据，为其进一步开发利用打下了基础。参考文献[1] Ch．P(2005) VolⅠ（中国药典2005年版．一部）［S］．2005：63[2] XUN G Y，Yan Jun，Guo X Q. The improvement of Phenylhydrate-sulfuric acid method for Polysaccharide and preliminary application[J]. Food Science（食品科学），2005，26(8)：342～346
