论文：叠鞘石斛茎段组织培养与花芽诱导

论文：叠鞘石斛茎段组织培养与花芽诱导

【摘要】  　　目的研究叠鞘石斛的快速繁殖及离体开花的培养体系。方法选用野生的叠鞘石斛带侧芽的茎段作为外植体，培养在附加不同激素的培养基上。结果MS培养基附加6-BA（1.0 mg·L-1），NAA（0.5 mg·L-1）对侧芽的诱导效果最佳。而MS培养基附加6-BA（2.0 mg·L-1），NAA（0.4 mg·L-1）最适合丛生芽的增殖。把无菌苗培养在附加6-BA（2.0 mg·L-1）的MS培养基中，少数植株被诱导开花，诱导率为10.0%。结论用带腋芽的茎段作为外植体在MS培养基中，附加一定的6-BA和NAA可以诱导丛生芽的产生。

【关键词】  叠鞘石斛； 组织培养； 花芽诱导　　

Abstract：ObjectiveTo study rapid propagation and in vitro flowering system for Dendrobium denndanum.MethodsStem with lateral buds of wild  denndanum was used as explants and cultured on various culture media with different portions of hormone.ResultsThe best medium for lateral buds induction was the MS with addition of 6-BA (1.0 mg·L-1),NAA (0.5mg/L), while MS with the addition of 6-BA (2.0 mg·L-1),NAA (0.4 mg·L-1) was suitable for the cluster shoots propagation. A few plantlets were induced flowering after cultured on MS medium with addition of 6-BA (2.0 mg·L-1), the frequency of floral bud induction was 10.0%.ConclusionThe cluster shoots can be induced from the segments with lateral buds on the MS basic medium with addition of 6-BA and NAA.　　

Key words：Dendrobium denndanum;   Tissue culture;   Induction of floral buds     　　

石斛是常用名贵中药材，属兰科（Orchidaceae）石斛属Ddendrobium。现已发现，该属有很多种类具有药用价值，其中铁皮石斛、金钗石斛、霍山石斛等药用价值很高，价格昂贵。石斛中含有多种生物碱、抗癌菲、类黄酮等物质，具有抗衰老、增强机体免疫力等作用［1］，其应用范围较广，需求量不断增加。但近年来由于受过度采伐、生长缓慢、繁殖率低等因素的影响，使石斛的野生资源严重枯竭，我国已将其列为濒危药用植物［2］，为挽救石斛属的植物物种，扩大药源，前人已对多种石斛属的植物进行了组织培养快速繁殖的研究［3～6］，但对叠鞘石斛的组织培养目前尚未见报道。本文报道了叠鞘石斛茎段在不同激素配比培养基中出芽、发育成苗的过程，同时初步进行了离体开花的诱导。　　

1   材料与方法　　1.1  材料供试材料叠鞘石斛Dendrobium denndanum采于贵州省紫云县，并经贵州大学生命科学学院植物学教研室鉴定为叠鞘石斛。标本种植于贵州大学植物标本地。　　

1.2  材料处理与接种选取生长健壮、无病虫害感染的茎段，将其截成长1～1.5 cm的带芽茎段，用流水冲洗1 h，在超净工作台用75%的酒精消毒30 s，再用0.1%的HgCl溶液消毒12 min，无菌水冲洗5次。将此茎段接种于芽启动培养基上。每个配方接种10瓶，每瓶接种5段，22～24℃，光照12 h/d，光强度2 000 lx条件下培养。　　

1.3   培养基　　

1.3.1   芽启动培养基①MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+2%蔗糖+0.8%琼脂；②MS+6-BA 1.0mg·L-1+ NAA 1.0 mg·L-1+2%蔗糖+0.8%琼脂；③1/2MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+2%蔗糖+0.8%琼脂；④1/2MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+2%蔗糖+0.8%琼脂。　　

1.3.2  芽增殖培养基①MS+NAA 0.4 mg·L-1+ 不同浓度6－BA（单位同前） +2%蔗糖+0.8%琼脂；②MS+NAA 0.4 mg·L-1+ 不同浓度KT（单位同前） +2%蔗糖+0.8%琼脂； ③MS+NAA 0.4 mg·L-1+ 不同浓度ZT（单位同前）+2%蔗糖+0.8%琼脂。　　

1.3.3  生根培养基  ①MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1 +2%蔗糖+0.8%琼脂；② MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1 +2%蔗糖+0.8%琼脂；③ MS+6-IBA1.5 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1+2%蔗糖+0.8%琼脂。　　

1.3.4   成花诱导培养基① MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1 +2%蔗糖+0.8%琼脂；②  MS+ ABA 0.5 mg·L-1+2%蔗糖+0.8%琼脂；③ MS+2－4D 0.1 mg·L-1+6-BA0.5mg·L-1+2%蔗糖+0.8%琼脂；④ MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2%蔗糖+0.8%琼脂；上述培养基pH均为5.8。　　2   结果　　

2.1  启动培养外植体培养30 d后，茎节部的侧芽开始萌动，与培养基接触的部位逐渐形成乳白色的瘤状突起，以后突起逐渐膨大，颜色由白转绿（见图1），大约40 d以后芽开始伸长， 60 d后形成丛生状小苗。几种诱导启动培养基均能诱导芽的萌发(见图2)，其中以培养基①和③中产生的芽多。培养基① 和③ 所含的激素浓度相同而基本培养基不同，分别是MS培养基和1/2MS培养基，说明基本培养基对叠鞘石斛芽的萌发影响不大，6-BA和NAA的浓度对芽的萌动和发育有一定影响，当6-BA在1.0 mg·L-1，NAA在0.5 mg·L-1时对芽的萌发生长最有利。此外，选择靠近茎尖的茎节端，通常容易诱导芽的萌发，这可能与茎尖主要由具有胚性的分生细胞构成，其分裂能力高于茎段的其它部位。　　

2.2  丛生芽的增殖培养 把无菌苗从茎上切下转接到增殖培养基中培养。大约10 d左右，在原来萌发的芽周围开始产生不定芽,进而形成丛生芽，连续转接2～3次，可以不断增加丛生芽的数量。常用的细胞分裂素有KT，ZT，6-BA，将这3种激素及不同浓度配比的增殖培养基对芽的增殖进行比较（见表1）。结果表明，6-BA的对丛生芽的增殖效果最明显，平均芽增殖倍数为7.3倍，其中当浓度为2.0 mg·L-1时，形成较多的丛生芽，形成的丛生芽最多、且长势好（见图3），芽的增殖倍数最高，为9.0倍。从表中看出，6-BA影响芽增殖的3个实验浓度中，芽的增殖倍数与6-BA质量浓度成正相关。KT和ZT对芽的增殖也有一定的作用，但效果较6-BA稍差。相同激素不同质量浓度的差异性比较，P值大于0.05，而不同激素组合相同质量浓度的显著性分析，P值大于0.05。KT质量浓度的不同对芽增殖的影响无明显的影响。而ZT的两个实验浓度对芽的倍增数也无显著的影响。

2.3  生根培养将叠鞘石斛健壮无菌苗转入生根培养基，大约15d左右，在芽的另一端产生被白色根被覆盖的幼根，以后根开始生长，每株生根2～3条。几种培养基都能诱导根的产生，其中以MS+6-BA 2.0 mg·L-1 +NAA 0.4 mg·L-1最好，生根率达91％，MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1培养基对生根的诱导率为88％，与MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1培养基的诱导率接近。而MS+6-IBA1.5 mg·L-1+NAA0.4 mg·L-1对根的诱导率相对较低，仅为80％。从生根的时间看，3种培养基的生根时间差别不大，为14～16d， 3种配比的培养基促发新根数量以MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.4 mg·L-1最多，平均为6条，而另外两种配比的培养基促发根的数量平均为4条。　　

2.4  花芽的初步诱导将长至株高约2cm左右、发育良好的无根苗转入诱导成花的培养基中，4种类型的成花诱导培养基分别接种10瓶，每瓶接种3个外植体，2个月后，仅有培养基④中的少部分植株形成花芽并开花，其余未见花芽形成，诱导成花的培养基④中，30个植株仅有3株开花，诱导率为10%。花芽生自顶芽位置，且生于丛生苗中（见图4）。但花朵未完全开放，1周左右即枯萎。由于仅有培养基④中少量的植物诱导开花，难以看出培养基类型、激素类型和配比与成花的相关性。　

3  讨论    　　组织培养获得石斛再生植株的途径有器官发生型和原球茎发生型［6］。器官发生型是通过外植体组织培养，使预先存在的分生组织形成芽(如腋芽)或不定分生组织(如子叶、茎段、愈伤组织等)形成不定芽，该方法是石斛快速繁殖的主要方法。原球茎发生途径是通过石斛适宜外植体诱导产生胚性愈伤组织并增殖,随后形成类胚组织原球茎进而发育成完整的再生植株。原球茎再生植株的方式技术上相对较困难，周期长，需反复壮苗，而直接用带腋芽的茎段诱导丛生芽，具有取材方便、操作简便、繁殖系数高等优点，可以较短时间内获得大量无菌苗。对叠鞘石斛的组织培养，目前尚未见报道。本实验结果对叠鞘石斛的离体快繁和野生种质资源的保存具有一定的参考价值。    　　

此外，作者对叠鞘石斛的离体成花作了初步尝试。前人对兰科植物离体条件下的花芽形成已有不少报道［7～9］，兰科植物可以用原球茎和幼小植株进行成花诱导。笔者仅对长有茎叶的小植株进行诱导。结果表明，单加6-BA对花芽的形成有一定的促进作用，这与王远光等［8］的结果相一致。植物的开花与外界因子和内在因素的变化存在复杂的关系，影响植物成花的主要外界因子如光周期、温度、水分、营养等在很大程度上是通过影响植物内源激素而起作用。因此，有关植物离体开花的研究还需从生理生化、分子生物学方面作更深入、仔细的研究。

 

 

【参考文献】  　　［1］ 夏鸿西.石斛属植物化学成分研究进展［J］.实用药学,1999,13(3):11.　　［2］ 宋经元,郭顺星,肖培根.近10年来石斛属植物的研究进展［J］.中国中药杂志,2004,39(10):725.　　［3］ 孙 廷,杨玉珍,胡如善. 金钗石斛的组织培养与快速繁殖技术［J］.河南科技大学学报（农学版）,2004,24（3）：35.　　［4］ 高培元,陈健妙,甘 铨. 金钗石斛的茎段组织培养与植株再生［J］.中草药,2002,33（11）:1031.　　［5］ 朱 艳,秦民坚.铁皮石斛茎段诱导丛生芽的研究［J］.中国野生植物资源,2003,22（2）:56.　　［6］ 张 明,夏鸿西,朱里泉,等. 石斛组织培养研究进展［J］.中国中药杂志,2000,25（6）:323.　　［7］ 王光远,许智宏,蔡德发,等. 铁皮石斛的离体开花［J］.中国科学（C辑）,1997,27（3）:229.　　［8］ 王光远,刘 培,许智宏,等.石斛离体培养中ABA对诱导花芽形成的影响［J］.植物学报,1995,37(5):374.　　［9］ 温云飞,鲁润龙,谢子立.霍山石斛的快速繁殖和花芽诱导［J］.植物生理学通讯,1999,35（4）:296.