铁皮石斛组培苗生产技术及存在的问题

  1 铁皮石斛的概述及其药用价值
 
     铁皮石斛,为石斛属珍稀濒危药用植物,又称黑节草,属于兰科附生兰类,具有益胃生津、滋阴清热、润肺明目等功效，是《中华人民共和国药典》收录的5种石斛属植物之一。铁皮石斛具有很高的药用价值，野生的铁皮石斛大多分布在东亚、东南亚及澳大利亚等国家和地区。我国主要分布于秦岭、淮河以南的云南、广西、广东、贵州、浙江等地的山区。铁皮石斛的种子无胚乳、极小,自然条件下需与某些真菌共生才能萌发,用实生苗栽培比较困难；而传统的分株、扦插等方式的繁殖率极低,加上人为的过度采挖和破坏生境,其资源已濒临灭绝,被国家列为重点保护的药用植物之一。目前,必须通过人工育苗和种植才能满足国内外市场的需要。采用组织培养技术繁殖铁皮石斛的研究已经很多,但是真正运用于生产,能够产生规模效益的却为数不多。主要是因为铁皮石斛试管种苗移植成活率太低,成为种苗产业化生产的瓶颈。因此，规范铁皮石斛组培苗产业化生产具有非常重要的意义，本文结合前人的研究经验，总结了铁皮石斛组培苗产业化生产中的关键技术，望能够为铁皮石斛组培苗的规模化生产提供依据。
 
     2外植体的选择
 
     用于铁皮石斛组织培养的外植体主要有幼苗茎段、种子等，其中以种子作为外植体在铁皮石斛组培苗工厂化生产中应用较为广泛。通过茎段和种子培养都能完成铁皮石斛种苗快速繁殖。茎段培养通过丛芽增殖、种子培养通过原球茎实现种苗快速繁殖的目的。茎段培养苗可以保持母本的性状,而种子培养的种苗后代可能会发生变异。为了中药材的规范化栽培还是采用茎段培养生产种苗的方法为好。
 
     3培养基的选择
 
     铁皮石斛对于基本培养基的适应性较广。初代诱导培养及增殖培养多采用MS、N6基本培养基,生根培养多采用1/2MS、VW基本培养基。在诱导培养基中添加6-BA和10%椰子汁能促进种子萌发，缩短萌发时间。在种胚萌发产生大量的原球茎后，即可转入增殖培养基。在增殖培养过程中，宜采用添加有马铃薯50%和香蕉20%的MS培养基，增殖代数需控制在6代以内，加入适量的活性碳可以促进铁皮石斛原球茎的增殖。待分化出的幼苗长到1.0 cm左右，需及时将幼苗转到继代培养基中进行壮苗培养，否则幼苗会因为激素、添加物的不适应生长而出现大量的黄化死亡。壮苗培养选用MS基本培养基，适量加入NAA和6-BA，添加物为马铃薯50%和香蕉20%。待幼苗长到2～3 cm时，即可将苗转入生根培养基中，在生根培养中，可采用1/2MS培养基加入少量NAA，香蕉45%。在植株壮苗生根培养阶段加入活性炭，活性炭可吸附代谢过程中产生的废弃物，防止组织褐变，并能够刺激胚胎的发生与生根。
 
     4培养室管理
 
     在铁皮石斛组织培养过程中，培养温度和光照对组培苗有显著的影响。以种子作为外植体诱导原球茎，将种子接种在诱导培养基上，先采取3d的遮光处理，然后转入有光状态下培养，10天左右可观察到胚开始萌动，逐渐形成黄绿色的细胞块。在诱导阶段，培养温度为（25±1）℃，光照强度以1000 lx左右为宜，光照时间为每天12h。在增殖分化阶段，宜采用（25±1）℃恒温培养。研究表明，（25±1）℃培养对铁皮石斛原球茎增殖效果最好，温度较高或较低都不利于原球茎的增殖，温度过高原球茎增殖缓慢，生长不适应，部分原球茎死亡；温度较低表现为原球茎增殖速度降低。光照强度以2000 lx左右为宜，光照过弱则幼苗生长细弱，甚至徒长，无效苗增加。在生根壮苗培养阶段，培养所需温度较增殖分化培养为低，（23±1）℃为最适宜温度。温度太低影响植株体内的代谢速率，从而影响植株生长；温度过高会影响到植株根生成的数量和质量，植株成活率变低。光照宜控制在3000 lx左右，以促进植株的生长和适应后期的炼苗过程。
 
     5存在的主要问题与分析
 
     （1） 优质种源问题
 
     种子种苗的优劣是影响铁皮石斛产业化发展的关键因素，近年来一些企业为了追求效益，将紫皮石斛与铁皮石斛，水草石斛与铁皮石斛杂交，其产生的种苗容易成活，产量高，但是却并不符合药典标准的铁皮石斛，并造成铁皮石斛品种混乱。在铁皮石斛组培苗生产中，必须采用铁皮石斛野生种质植株所结的果实，因为组培苗后代植株果实的种子用于组培育苗，其后代植株发生劣质变异严重，种质严重退化，药材性状及药效良莠不齐，品质低劣
 
     （2） 污染控制
 
     一般来说，污染是导致铁皮石斛组培苗出瓶率降低的主要原因。污染是铁皮石斛组织培养中普遍存在的问题,也是影响生产成本最重要的因素之一,污染率每上升5个百分点,生产成本将递增10%以上,污染严重时,会导致整个生产流程都难以正常运转。污染的来源有两种：一是培养材料自身带菌，这在使用非无菌铁皮石斛苗茎段作为外植体时容易发生，因为铁皮石斛在生长过程中本身就要和某些内生真菌共同作用促进生长；二是在培养过程中环境和操作带来的污染。理论上已经获得的无菌材料是无菌的，但在继代培养中也会出现污染，这除了操作的因素外，内生菌活动应是导致污染的一个重要原因，同时继代材料放置在培养架上，也容易被螨类等传播的菌所污染。为将组培苗污染控制在一个较低的水平，可以从以下几方面着手解决：
 
     1）控制外植体带菌。铁皮石斛的果实为蒴果，果皮较厚，可以隔绝外部的菌源污染，接种消毒过程可以稍长，可用10%次氯酸处理10～15 min，最大限度地消除果皮上残留的真菌、细菌污染。用铁皮石斛茎段作为外植体接种，在用次氯酸表面消毒后可视材料情况再进行二次消毒，尽量降低污染概率。也可采用无菌苗的茎段作为外植体。
 
     2）接种人员要做到尽量少带菌，严格操作要求。接种人员应穿戴专用的工作服、无菌鞋、帽子及口罩，手要用75%酒精消毒。接种过程中不应频繁开启无菌室门窗。要定期打扫或熏蒸培养室，操作过程中产生的垃圾不得在接种室停留超过4小时，定期检查超净工作台的工作质量，对感染杂菌的培养瓶要及时灭菌处理，不能随意弃置，以防病原菌在周围环境中传播。
 
     3）经常检查灭菌锅的灭菌质量，发现问题立即检修。灭菌锅的压力表降至零后不得马上出锅，避免产生的负压效应致使外界冷空气倒吸入已灭菌的培养瓶内引起污染，因此灭菌后培养瓶应待锅内稍冷却后才出锅。检查培养容器是否存在问题，培养容器封口多采用塑料盖、胶塞、棉塞、薄膜等，塑料盖用久了易老化，密封性差，也会造成污染。
 
     4）及时转接。要降低污染,除了一般措施,如接种室、缓冲间、培养室及培养基贮藏室定期消毒,强化接种人员的“无菌操作”概念外,及时转接可同时减少以上问题的发生率。管理人员要随时观察种苗的生长状况,在种苗的长势较好、生长密度有利于观察瓶苗是否已污染时,尽快转接,这样既可以截断污染源,又可以给植物及时更换生长环境,提供新的营养物质,杜绝植株死亡现象。

     5）控制基数。由于的增殖倍数较高,但生长缓慢。常规的接种方法导致当苗高达到出瓶要求时,继代苗将增加几十倍。现有的接种工人要做到及时转接,只能不断增加劳动力,由此带来的结果是种苗基数越来越大,生产流程处于一个无序状态,要解决这一矛盾,关键是控制好基数,丢弃无效苗,优选健壮植株继代。
 
     6 结语
 
     目前，铁皮石斛的供给还远远达不到市场的需求，铁皮石斛的规模化种植以及种苗生产还有很大的发展空间。因此需要加快铁皮石斛优质种苗产业化生产，扩大规模，提高产品的质量。目前石斛组培苗工厂化生产技术虽已较为成熟，但在人工操作的过程中还是容易受到各种因素的影响，因此一定要注意和控制好各个环节，严格按照规范操作。特别是污染控制环节，不断提高操作人员的技术水平，才能确保产品的数量和质量。同时，随着产业发展的需要，对优良种苗的要求也会越来越高，因此需要开展种质资源收集、品种选育等基础性研究，对现有铁皮石斛品种进行改良研究。并将这些研究与生产应用相结合，实现铁皮石斛规范化、标准化、产业化生产。