论文：齿瓣石斛多糖提取及脱蛋白工艺研究
论文：齿瓣石斛多糖提取及脱蛋白工艺研究
作者：赵俊凌，马洁，李戈，段立胜
【摘要】 目的通过正交实验对齿瓣石斛多糖的提取工艺、脱蛋白条件进行优化研究。 方法采用苯酚-硫酸法考察提取温度、提取时间及溶剂体积等因素对多糖提取的影响,采用比色法考察样品与萃取剂体积比、萃取剂体积比、振荡时间等因素对多糖脱蛋白的影响。结果多糖提取的最佳条件，提取温度100℃，提取时间 2 h，加水量200 ml，提取2次，醇沉浓度为80%，醇沉时间30 h;多糖脱蛋白的最佳条件，样品/萃取剂(V/V)为4∶1，氯仿/正丁醇(V/V)为4∶1，萃取时间30 min。结论苯酚-硫酸法简单，易操作，可测定齿瓣石斛中多糖含量。
【关键词】 齿瓣石斛; 多糖; 提取工艺; 脱蛋白; 正交实验石斛属Dendrobium是兰科中的第二大属，全球共有约一千五百多种，主要分布于亚洲的热带和太平洋岛屿的东亚、东南亚及澳大利亚等地区，我国有76种(74个种，2个变种) 主要分布于华南及西南地区。石斛作为一种名贵中药被《本草纲目》收录，在《神农本草经》中也被列为上品，其有养胃生津、滋阴清热、明目的功能,用于阴伤津亏,口干烦渴,食少干呕,病后虚热,目暗不明等症状。现代药理研究发现石斛属植物具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗血小板聚集、扩张血管、降低血糖等多种活性[1]，同时在治疗胃肠道疾病和治疗白内障方面也有很好疗效。
齿瓣石斛Dendrobium devonianum Paxt为石斛属植物，又名紫皮石斛或紫皮兰，主要分布于我国的云南、广西、贵州等省，缅甸、越南、老挝、泰国也较多，具有“滋阴益胃，生津止渴”之功效。我国及许多其它亚洲国家一直把齿瓣石斛的茎当作生产枫斗的原料,主要用其当年生的幼嫩茎加工生产紫皮枫斗、细黄草，或者替代紧缺的铁皮石斛生产铁皮枫斗，产品销售国内外，深得国内外消费者的青睐，其价格和质量仅次于铁皮石斛。近年来其价格呈上升趋势，鲜品价格已达160元/kg，而紫皮枫斗的价格也达到2 000～4 000元/kg[2]。
国内外对齿瓣石斛的药理和化学成分的研究都相对较少。李满飞等[3]报道了用比色法测定石斛多糖时测定了齿瓣石斛，其多糖含量为21.09%;熊丽萍等[4]报道了紫皮石斛14.27%,其水体液对超氧阴离子有抗氧化作用;吴刚等[5]报道了云南文山产齿瓣石斛的多糖含量37.05%;黎英等[6]报道了齿瓣石斛的水提物具有清除活性氧的活性;郑志新等[7]报道了齿瓣石斛含有石斛多糖、矿质元素、氨基酸等有效成分。目前以齿瓣石斛(紫皮石斛)为主的产品较单一，具有很大的市场潜力。本实验对齿瓣石斛多糖的提取及纯化工艺进行研究，为齿瓣石斛开发利用提供参考。
1 材料与仪器
1.1 材料齿瓣石斛Dendrobium devonianum产地为云南省，由中国医学科学院药用植物研究所云南分所王云强助理研究员鉴定。
1.2 试剂与仪器苯酚、浓硫酸、石油醚、无水乙醇、氯仿、正丁醇、丙酮、乙醚等均为分析纯。旋转蒸发器R-210(瑞士布奇)，TU-1901新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)， 数显恒温水浴锅HH-4(常州国华电器有限公司)，GZX-9140恒温数显鼓风干燥箱(上海博讯设备有限公司)，METTLER TOLEDO系列分析天平AB135-S，PL203。
2 方法与结果
2.1 标准溶液配制[3]精密称取 105℃干燥恒重的标准葡萄糖 100.0 mg，置100 ml容量瓶中，加蒸馏水适量使溶解，稀释至刻度，摇匀。精密吸取 10 ml置100 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，每毫升含葡萄糖0.1mg。
2.2 检测波长的选择精密吸取标准葡萄糖溶液0.3 ml，置于具塞比色管中，加蒸馏水至 2.0 ml，再加苯酚试液1.0，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0 ml，盖好塞子，迅速摇匀，放置 5 min，置沸水浴中加热15 min，取出，冷水迅速冷却至室温，作为供试溶液。另以 2.0 ml蒸馏水同样操作，作为空白对照，在400～600 nm范围对供试溶液进行扫描。葡萄糖溶液在490 nm波长处有最大吸收度,齿瓣石斛多糖溶液在490.50 nm波长处有最大吸收度,故选490.50 nm作为样品的测量波长。
2.3 标准曲线制作精取葡萄糖对照液，0.1，0.2 ,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7 ml，分别加入具塞比色管中，加蒸馏水使成2.0 ml，各加苯酚试剂1.0 ml，在旋转混匀器上摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0 ml，摇匀，放置5 min，置沸水浴中加热15 min，冷水迅速冷却至室温。另以蒸馏水2.0 ml同法操作，作为空白对照，在490 nm处测其吸收度。以吸收度值为Y,葡萄糖浓度为X，得回归方程： Y =0.008 11+0.017 31X，r=0.999 5，说明该工作曲线在5.00～35.00 μg间的线性良好。
2.4 精密度实验精取供试溶液5份，每份0.3 ml，加蒸馏水使成2.0 ml,各加苯酚试剂1.0 ml,按标准曲线操作,测定其吸收度。测定结果，葡萄糖RSD=1.23%，齿瓣石斛RSD=0.74%，精密度较好。
2.5 重复性实验精取干燥后的样品6份，分别提取，每份供试溶液取0.3 ml，加蒸馏水使成2.0 ml,各加苯酚试剂1.0 ml,按标准曲线操作,测定其吸收度。测定结果，齿瓣石斛RSD=1.46%，重复性良好。
2.6 显色稳定性实验精取供试溶液0.3ml,加蒸馏水使成2.0 ml,加苯酚试剂1.0 ml,按标准曲线操作,分别测定 30，60，90，120，150，180，210，240 min的吸收度。测定结果，葡萄糖RSD=0.41%，齿瓣石斛RSD=0.48%，240min内有较好的光稳定性。
2.7 多糖精制精密称取齿瓣石斛干燥后粗粉10 g ，加入石油醚(60～90℃)100 ml，回流提取1 h，脱脂。过滤，挥干溶媒，以80%乙醇200 ml回流提取1 h，趁热过滤，挥干溶媒，加入蒸馏水500 ml回流提取2次，2 h/次，趁热过滤，减压浓缩至60 ml，用0.1%活性炭脱色，过滤，加入95%乙醇使溶液含醇80%，静置过夜，分出沉淀物溶于蒸馏水，Sevag法脱蛋白。上清液如上述醇沉，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤3次。将沉淀如上脱色、醇沉，得到多糖精制品于60℃烘干备用。
2.8 换算因素 精确称取60℃干燥至恒重的石斛多糖精制品各10 mg，分别置于100 ml量瓶，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，作为储备液。分别精取多糖储备液0.3ml，按照标准曲线制备的方法操作，测定吸收度。另取葡萄糖标准溶液0.3ml(含葡萄糖30μg)，同法操作，求出石斛多糖溶液中的葡萄糖含量，按下式计算换算因素:F=多糖溶液的浓度/多糖溶液中的葡萄糖浓度×稀释倍数。f=1.445。表1 换算因素
2.9 提取工艺 2.9.1 正交实验设计以提取温度(A)、提取时间(B)、溶剂体积(C)为影响因素，选取3个不同水平，以石斛多糖的含量为考察指标，采用L9(34)正交设计实验进行提取工艺的筛选[4,7～9]。表2 多糖提取正交实验 2.9.2 浸提次数实验根据上述试验所得最佳提取条件,取9份样品进行平行实验，每3份样品为一组，分别提取1，2，3次,研究多糖浸提次数与石斛多糖得率的关系。
2.10 样品测定 石斛样品经60℃干燥恒重，粉碎，过60目筛，精密称取0.500 g，置于500 ml的蒸馏烧瓶，加入50 ml石油醚(60～90℃)回流脱脂1h，过滤，挥干溶媒;80%100 ml乙醇提取1 h,残渣用80%热乙醇8 ml洗涤3次;加入200 ml蒸馏水回流提取2 h，趁热过滤，用热水洗涤残渣和烧瓶;冷却后，定容为250 ml。精取上述多糖溶液0.3ml，按标准曲线项下操作，按下式计算样品中多糖的含量。多糖含量(%)=Cs×D×F×V/ W式中：Cs为供试品溶液中葡萄糖浓度(μg/ml)，D为供试品溶液的稀释因素，F为换算因素，V为供试溶液体积(ml)，W为供试品质量(μg)。
2.11 醇沉实验
2.11.1 乙醇浓度取一定量石斛多糖提取液分装于5只离心管中，并分别加入95%的乙醇，使乙醇的终浓度分别为50%，60%，70% ，80% ， 90% ，4℃冰箱中静置过夜，离心，60℃烘至恒重，采用差重法检测乙醇浓度对多糖沉淀效果的影响。
2.11.2 沉淀时间另取5支刻度离心管，分别加入等量的多糖提取液，并用乙醇使其终浓度达到80% 。在醇析12，24，36，48，60 h后，离心，60℃烘至恒重，采用差重法测定沉淀时间对多糖含量的影响。
2.12 Sevag法脱蛋白实验[10]以石斛粗多糖溶液与氯仿-正丁醇体积比(A)，氯仿与正丁醇配比(B)以及振荡时间(C)等为影响因素进行正交实验，每个处理重复3次，考察Sevag法去蛋白质的效果，分别测定处理前及处理后多糖溶液在280 nm处的吸光值。脱蛋白率(% )=原样品吸光值-脱蛋白后样品吸光值 /原样品中吸光值。
2.13 数据处理 所有统计分析均采用spss13.0软件和Excel软件处理。
3 讨论
3.1 多糖提取工艺按照“2.9”项中描述的方法对浸提温度(A)、浸提时间(B)、加水量(C)等3个因素进行正交实验，结果见表4，各因素作用大小关系依次是A>C>B，多糖提取的最佳工艺配比为组合3，即 A1B3C3，提取温度100℃，提取时间2 h,加水量200 ml。从表5可知，浸提温度(A)与加水量(C)对齿瓣石斛多糖含量有显著的影响意义(0.01 表3 粗多糖脱蛋白正交实验表4 多糖提取正交实验结果表5 多糖提取方差分析
3.2 提取次数齿瓣石斛样品在提取2次后，多糖基本上已被提取完全，最佳提取次数为2次(见表6)。表6 提取次数对多糖提取率的影响
3.3 醇析实验在乙醇终浓度为80%时,多糖含量最高,当浓度更高时析出的多糖会有所下降(见图1)。在80%醇析浓度下(见图2),大约在24～36 h之间,多糖含量达到最大值, 36 h后多糖含量降低,选择30 h作为沉淀时间。图1 醇沉浓度 图2 醇沉时间
3.4 Sevag法脱蛋白见表7。脱蛋白实验结果表明，各因素的R值分别为振荡时间(C)>样品与氯仿-正丁醇体积比(A)>氯仿与正丁醇体积比(B)，反应时间是影响齿瓣石斛多糖脱蛋白的主要因素，齿瓣石斛多糖纯化的最佳组合为A2B2C3。即氯仿与正丁醇(V/V)的体积比为4∶1，样品/萃取剂(V/V)的体积比为4∶1，反应时间采用30 min。从表8可知，振荡时间(C)与样品与氯仿-正丁醇体积比(A)对多糖脱蛋白有一定的影响意义(0.05 表7 脱蛋白正交实验结果表8 脱蛋白正交实验分析
4 结论 齿瓣石斛多糖提取最佳工艺，100℃热水中回流提取2 h，水体积200 ml,提取2次;醇沉实验的最佳乙醇浓度为80%，沉淀时间30 h;粗多糖脱蛋白的最佳条件，样品/萃取剂(V/V)为4∶1，氯仿/正丁醇(V/V)为4∶1，振荡时间30 min。
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