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论文:铁皮石斛茎节离体培养的研究

2020-03-13 08:20:29 0
论文:铁皮石斛茎节离体培养的研究 【摘要】 目的通过无菌茎段实现铁皮石斛快速繁殖。方法将铁皮石斛试管苗茎节接种于不同NAA

论文:铁皮石斛茎节离体培养的研究

【摘要】  目的通过无菌茎段实现铁皮石斛快速繁殖。方法将铁皮石斛试管苗茎节接种于不同NAA浓度的MS培养基上诱导腋芽萌发,并在含不同激素配比和有机添加物的培养基上继代和诱导生根。结果NAA 0.4 mg/L,6-BA 5 mg/L时铁皮石斛腋芽萌发率达93.33%;NAA 0.3 mg/L,6-BA 2 mg/L时丛苗的生根率达96.67%,香蕉汁和土豆汁能够显著促进丛生芽的增殖和壮苗生根。结论建立了适合铁皮石斛茎段离体培养的快速繁殖体系。

【关键词】  铁皮石斛 无菌茎节 离体培养 激素浓度 有机添加物  

Abstract:ObjectiveTo develop a rapid propagation of Dendrobium candidum using the aseptic nodal segments of shoots.MethodsAxenic nodal segments were first  germinated on Murashige and Skoog(MS)basal medium supplemented with different concentration NAA.The seedlings were subcultured and rooted on the medium containing different concentration hormones and organic susbstance.Results93.33% of the axenic nodal segments of Dendrobium candidum germinated on the medium with NAA 0.4 mg/L,6-BA 5 mg/L and 96.67% of explant rooted on the medium containing NAA 0.3 mg/L,6-BA 2 mg/L.The growth of explant was promoted by the extract of banana and potato.ConclusionThe in vitro propagation of Dendrobium candidum from axenic nodal segment has been established.  

Key words:Dendrobium candidum;  Axenic nodal segments;  In vitro propagation;  Concentration of hormone;  Organic susbstance  

石斛最早见于《山海经》,药用始载于《神农本草经》,其后,历代诸家本草均予录述。在《本草纲目》中被列为上品。至今石斛仍是中医常用的滋阴清肺、生津止渴、养胃除烦之要药,其应用范围更有扩大之势。近年研究发现石斛中含有石斛多糖[1]、生物碱[2~4]、鼓槌菲和毛兰素[5]等化合物,以及7种人体必需氨基酸[6]和多种微量元素。现代药理表明石斛具有抗肿瘤[7]、抗衰老、增强免疫力[8]等功能,对心血管、消化系统、呼吸系统和眼科疾病均有明显的治疗作用[9]。  

铁皮石斛Dendrobium candidum是现行版《中国药典》收载的5种常用石斛之一,是石斛类药材的上品。铁皮石斛又名黑节草、铁皮吊兰、铁皮兰,属兰科石斛属附生植物。加工后的铁皮石斛又被称为铁皮枫斗,市场价格昂贵,是一种经济价值和医用价值都很高的名贵中药。然而由于近年来过度采伐、生态环境破坏等原因,铁皮石斛野生资源日渐匮竭,而其对生境要求苛刻、自然繁殖率低等因素进一步将铁皮石斛推向灭绝的边缘,现在已被列为濒危保护的中药品种[10]。利用铁皮石斛体外快繁是解决目前铁皮石斛资源与需求矛盾的重要途径。目前关于铁皮石斛的研究主要集中在原球茎增殖、分化等方面[11,12],以茎节为材料,实现铁皮石斛体外快繁的研究尚鲜见报道。本研究拟通过无菌茎段的离体培养,建立适合铁皮石斛的快速繁殖体系。  

1  材料与方法  

1.1  材料  

选择与处理以本实验室培养保存的生长旺盛、茎节粗壮的铁皮石斛试管苗为材料,切成长度为1~1.5 cm带1~2个腋芽的小茎段。  

1.2  腋芽萌发将无菌茎段接种于添加30 g·L-1蔗糖、8.0 g·L-1琼脂、pH为5.6的MS培养基上。其中6-BA 5 mg·L-1,并加入不同浓度的NAA(0~0.8 mg·L-1)。培养温度为25 ℃,光照强度为2 000 lux,光照时间为12 h·d-1。定期观察不同浓度生长素对铁皮石斛腋芽萌发的作用。  

1.3  丛生芽增殖将已萌发的腋芽接种于MS+30 g·L-1 蔗糖+NAA 0.4 mg·L-1+6-BA 5 mg·L-1,并添加200 g·L-1的香蕉、土豆、西瓜、豆芽的增殖培养基上,并以不加天然添加物的培养基为对照,pH均为5.6,考察不同提取物对丛生芽增殖的影响。培养条件同上。  

1.4  壮苗生根将生长健壮,株高为2 cm左右的丛生苗接种于MS+30 g·L-1蔗糖+8.0 g·L-1琼脂,激素浓度分别为NAA 0.1,0.3,0.5 mg·L-1和6-BA 2,4 mg·L-1或MS+30 g·L-1蔗糖+NAA 0.3 mg·L-1+6-BA 2 mg·L-1 +8.0 g·L-1 琼脂,添加200 g·L-1不同提取物的生根培养基上,进行诱导生根和壮苗试验。培养条件同上。  

1.5  统计试管苗生长状况试管苗接种培养50 d后,分别观察统计芽诱导率、芽增殖数、株高、根诱导率、生根数、根长、植株健壮度及褐化程度。  

2  结果  

2.1  不同生长素浓度对茎段腋芽的诱导作用在6-BA 为5 mg·L-1时,不同浓度的NAA诱导茎段腋芽萌发的结果如表1所示。由表1可知NAA对铁皮石斛茎段腋芽萌发的作用与其浓度有关。当加入浓度较低时,NAA能够显著促进腋芽萌发,NAA 浓度为0.4 mg·L-1时,腋芽萌发率、增殖倍数达到最高,分别为93.33%和1.97,而且叶色黑绿,茎粗壮,形成大量丛生芽。而NAA浓度继续升高时,腋芽萌发率及增殖倍数均明显下降,而且由于部分材料坏死,导致实验中的总芽数减少。实验中还发现当NAA浓度过高时,部分腋芽萌发后,发生畸变,分化为花芽,并逐渐枯萎死去。结果表明低浓度的NAA 可以促进铁皮石斛腋芽萌发,诱导芽的分化,植株生长健壮。但NAA的浓度过高时,则会抑制腋芽的萌发和植株生长,并促进花芽形成,更适于观赏石斛的培养。根据实验结果,以NAA 0.4,6-BA 5 mg·L-1为继代培养基,对试管苗进行继代培养,结果生长良好、植株健壮、增殖倍数高(达到3.2倍)。表1  NAA对铁皮石斛腋芽萌发的影响(略)  

2.2  不同提取物对芽增殖的影响不同提取物对铁皮石斛芽增殖的作用显著不同。香蕉、土豆、西瓜均能显著提高芽增殖倍数,其中加入香蕉汁最有利于铁皮石斛的芽增殖,达到4.98倍,其次是土豆,为4.90倍。香蕉汁和土豆汁不仅可以促进芽的分化,同时也有利于芽的生长,平均芽长分别达到1.30 cm和1.39 cm,植株非常健壮。豆芽汁对芽增殖和生长没有促进作用,植株健壮程度一般,不宜用于铁皮石斛培养。此外,在培养过程中空白组、香蕉组、西瓜组的培养基均出现不同程度褐化,材料根部变黑等现象,但土豆组的培养基未出现任何褐化现象。结果见表2。表2  不同提取物对铁皮石斛芽增殖的影响(略)  

2.3  不同激素配比对铁皮石斛生根的影响将丛生苗接种于不同激素配比的生根培养基中,15 d后可以观察到少数几瓶有根形成,到20 d时,第2组的生根率达到58%,40 d时已经达到96.67%,之后生根率不再增长。不同的激素配比诱导铁皮石斛丛生苗生根的能力明显不同。较低浓度的6-BA有利于石斛生根;而NAA在低浓度时,其促进生根的能力与浓度呈正相关,当浓度过高时(0.5 mg·L-1),其促进生根的能力减弱。当NAA 0.3 mg·L-1,6-BA 2 mg·L-1时,铁皮石斛的生根率最高,达到96.67%,此时株高、根数、根长及健壮度都最好,但芽增殖倍数较低。因此以诱导生根为目的时,最适激素配比为NAA 0.3 mg·L-1,6-BA 2 mg·L-1。结果见表3。表3  不同激素配比对铁皮石斛生根的影响 (略)  

2.4  不同提取物对铁皮石斛生根的影响  不同提取物在不同方面对铁皮石斛壮苗生根培养具有显著作用。香蕉汁最有利于铁皮石斛壮苗生根,无论是芽增殖倍数、株高、生根率、根数、根长,添加香蕉汁都明显优于对照组,根粗壮,整齐,叶色浓绿,茎粗节短。土豆汁能够促进丛生苗的增殖和生长,有利于获得健康粗壮的试管苗,无褐化现象,但对诱导生根具有抑制作用。而西瓜汁的作用与土豆汁相反,它可以显著提高生根率和根数,但植株弱小,茎细叶少,根部部分叶变黄枯萎,根细而短,部分失去向地性。结果见表4。表4  不同提取物对铁皮石斛生根的影响(略)  

3  结论与讨论    本实验表明,在合适的培养条件下,铁皮石斛无菌茎段可以高效萌发。在MS+NAA 0.4 mg·L-1+6-BA 5 mg·L-1培养基上培养50 d后,腋芽萌发率、增殖倍数最高,分别为93.33%和1.97,植株生长健壮;以该培养基进行继代培养时,其增殖倍数达到3.2倍。以茎段为材料,实现铁皮石斛快速繁殖,可以拓宽组培材料来源,加快繁殖速度,促进大规模生产遗传形状稳定的试管苗。  

组织培养中常用的有机添加物如香蕉汁、西瓜汁和土豆汁等是一些富含氨基酸、激素和维生素等有机物且成分较为复杂的天然复合物,它们对细胞和组织的增殖和分化有明显的促进作用[13,14]。本研究表明,豆芽汁对铁皮石斛丛生芽增殖没有促进作用,不适合作为铁皮石斛增殖培养的有机添加物。香蕉、西瓜、土豆对丛生芽增殖均有促进作用。其中香蕉汁对丛生芽增殖、根的发生均有不同程度的促进,有利于培养壮苗。土豆汁可以显著提高芽增殖倍数,但对根的生成有抑制作用。在植物快繁中,培养基成本是生产成本的重要部分[13],利用土豆代替香蕉可以显著降低铁皮石斛工厂化生产的成本。西瓜汁则能够促进根的生成,提高根的数量,但根细而短小,部分失去向地性,竖直向上生长,植株生长较弱。秦改花等[15]发现单独添加有机物时,香蕉汁最有利于虎头兰原球茎的增殖,而同时添加香蕉汁和土豆汁时,效果更优于香蕉汁单独使用。不同有机物搭配使用是否能够取得类似效果尚有待于进一步研究。

 

 

【参考文献】    [1]黄民权,蔡体育.铁皮石斛多糖的提取,分离和分析[J].中草药,1994,25(3):128.  [2]金融鸾,孙继军,张远名.11种石斛的总生物碱的测定[J].南京药学院学报,1981,1:9.  [3]李亚芳,张晓华,孙国明.石斛中总生物碱和多糖的含量测定[J].中国药事,2002,16(7):426.  [4]陈晓梅,肖盛元,郭顺星.铁皮石斛与金钗石斛化学成分的比较[J].中国医学科学院学报,2006,28(4):524.  [5]马国祥,徐国钧,徐珞珊,等.反相高教液相色谱法翻定18种石斛类生药中chtysotoxene,erianin及chrysotoxine的含量[J].中国药科大学学报,1994,25(2):103.  [6]黄民权,阮金月.铁皮石斛氨基酸组分分析[J].中药材,1997,20(1):32.  [7]王天山,陆跃鸣.鼓槌石斛种化学成分对K562肿瘤细胞生长抑制作用体外试验[J].天然产物研究与开发,1997,9(2):1.  [8]黄民权,蔡体育.铁皮石斛多糖对小白鼠白细胞数和淋巴细胞移动抑制因子的影响[J].天然产物研究与开发,1996,8(3):39.  [9]林 萍,毕志明,徐 红,等.石斛属植物药理活性研究进展[J].中草药,2003,34(11):附19.  [10]淳 泽.药用石斛的资源危机与保护对策[J].资源开发与市场,2005,21(2):139.  [11]唐 凤,丁小余,丁 鸽,等.锗对铁皮石斛原球茎的生长及抗氧化酶系的影响[J].南京师大学报(自然科学版),2005,28(4):86.  [12]侯丕勇,郭顺星.悬浮培养的铁皮石斛原球茎在固体培养基上生长和分化的研究[J].中国中药杂志,2005,30(10):729.  [13]曹效东,曹孜义.植物试管繁殖的成本与效益浅析[J].植物生理学通讯,1996,32(4):284.  [14]何松林,孔德政,杨秋生,等.碳源和有机添加物对文心兰圆球茎增殖的影响[J].河南农业大学学报,2003,37(2):154.  [15]秦改花,田 芳,汤士勇.培养基中附加不同有机物对虎头兰原球茎增殖的影响[J].植物生理学通讯,2006,42(3):469.