论文：赤水金钗石斛rDNA ITS序列分析

论文：赤水金钗石斛rDNA ITS序列分析   作者：葛晓军，肖鲲， 李小琼， 唐彦萍

【摘要】  　　

目的： 对赤水金钗石斛ITS序列进行序列测定与分析，探讨赤水金钗石斛在ITS片段上的遗传特征，提高道地药材赤水金钗石斛在分子水平的鉴定标准。

方法： 用特异引物进行PCR扩增,扩增产物纯化后用双脱氧终止法(Sangerdideoxy)测序。

结果： 通过与基因库登录的金钗石斛ITS对照，赤水金钗石斛ITS1与ITS2序列的起止范围分别为1～231 bp和395～636 bp。赤水金钗石斛在8位缺失碱基C，在12位缺失碱基A，在82位为碱基A；据此，以NJ法（邻接法）构建了系统树。测序结果登录基因库，序列号：EF618732。

结论： 金钗石斛ITS1序列基因多态性比ITS2序列更显著；该实验结果为道地药材赤水金钗石斛的物种鉴定补充了新的遗传数据。

【关键词】  赤水； 金钗石斛； rDNA ITS　　

［Abstract］Objective: To study the genetic character of ITS sequence of Chishui D.nobile and obtain a good molecular marker for authentication of Chishui D.nobile, the rDNA ITS region sequences were investigated by the methods of DNA sequencing.Methods： The nuclear ribosomal ITS was amplified with primes P1 and P2，and then send the products to the sequencing company.  Results： By contrasting with Genbank, sequence analysis showed that the range of ITS1 was from 1 to 231, ITS2 from 395 to 636.Base C in site 8, Base A in site 12, Base A in site 82,were missed in ITS sequence of Chishui D.nobile. According the result,phylogenetic tree based on ITS sequences data was reconstructed by Neighbor joining method. The result of sequencing has been submitted to Genbank.Accession number is EF618732. Conclusion： The sequence of ITS1 contained more variable sites and potential informative sites than that of ITS2 among D.nobile species. By our result for Chishui D.nobile,New genetic data were also supplied to authenticate chishui D.nobile.　　

［Key words］Chishui；  Dendrobium nobile;   rDNA internal transcribed sequence   

金钗石斛为传统名贵中药材，药用历史悠久，在《神农本草经》被列为上品，并收载于2000年版的《中国药典》中，有“益胃生津、滋阴清热、明目利嗓”等作用。2006年3月23日，国家质量监督检验检疫总局批准对赤水金钗石斛实施地理标志产品保护，认定金钗石斛为赤水道地药材。伴随着金钗石斛药用价值、经济价值的不断提高，市场上的混淆品、假冒品不断涌现且屡禁不止。另一方面，在中药加工炮制的过程中中药材的成分也会发生变化，导致传统的中药材鉴定方法如性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定结果不稳定。这就迫使人们必须加强金钗石斛真品的鉴别。    　　

ITS（internal transcribed sequence）序列长度适中，从人类到酵母的各种真核生物中它的序列长度为1 000 bp到小于300 bp大小不等，人们可以从不太长的序列中获得足够的信息，可广泛用于属内种间或种内群体的系统学研究［1］。日渐成熟的rDNA片断序列分析技术，现已广泛应用于中药材的道地性鉴定,如太子参、杜仲、铁皮石斛［2］、泽泻［3］等的DNA分子鉴定。   

本实验用改良CTAB法［4.5］提取赤水金钗石斛DNA，并利用两个石斛ITS区特异引物，通过PCR扩增得到ITS片段，纯化PCR产物，用双向直接测序和克隆测序获得其ITS序列信息，对两种测序方法所得序列与基因库中已登陆金钗石斛序列进行比较分析。确定赤水金钗石斛与其他地方石斛ITS序列差异，为赤水道地药材金钗石斛提供分子鉴别资料。    　　

1  材料和方法　　

1.1  样本来源     金钗石斛共50株，采自赤水长期镇、官渡、石堡乡。　　

1.2  赤水金钗石斛总DNA提取及检测（改良CTAB法）    参照改良CTAB法［4］提取金钗石斛DNA，总DNA纯度及浓度的检测用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法。　　

1.3  PCR扩增金钗石斛ITS序列（包括5.8 S）及产物回收    ITS 的扩增引物参照Douzery等［6］的引物设计P1,上游引物：5′CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC3′, 位于18S 上；P2，下游引物：5′TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG3′，位于26S 上；采用标准的双链PCR 反应扩增核基因的整个ITS 片段(5′18S  3′26S,包括5.8S 编码区)，为了保证测序准确性，我们选取了高保真的DNA聚合酶。PCR反应参数为：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性1 min，56 ℃退火45 s，72 ℃复性2 min，循环30 次，然后72 ℃保温8 min，反应结束后，产物置4 ℃保存。与已登录基因库石斛属ITS序列（包括5.8 S）对照，经琼脂糖凝胶电泳，以Takara 50 bp DNA ladder标准参照物作为相对分子质量参照，按照UNTQ10柱式脱氧核糖核酸凝胶回收试剂盒说明书回收目的基因。　　

1.4  赤水金钗石斛PCR回收产物直接测序    将回收的PCR产物片段样品送上海生工生物工程公司直接测序。所用测序仪器为ABI PRISM 3730，测序试剂为BigDye terminator，测序引物为特异引物P1和P2。　　

1.5  赤水金钗石斛PCR回收产物克隆及测序     由于用高保真的DNA聚合酶所得的PCR产物为平末端，不能直接用于TA克隆，所以要经过：PCR回收产物加“A” 尾；与PMD18T载体的连接；重组载体的转化、筛选克隆；小量提取质粒；菌落PCR、质粒PCR鉴定克隆子；质粒的纯化鉴定步骤后将已纯化的重组质粒送上海生物工程公司测序。　　

1.6  直接测序与克隆测序结果分析    用ClustalX1.83软件对序列进行对位排列,手工适当校正以尽量减少排列所需缺失的数目,得到的序列用MEGA 3.1 分子进化遗传分析软件分析。在以公式p=ndn（其中n为所测定序列的核苷酸数,nd为核苷酸差异数）计算遗传距离的基础上，以邻接法建立分子系统发生树。系统树各分支的置信度用自举检验法（bootstrap）检验,共进行2 000次循环。　　

2  结果　　2.1  ITS序列扩增及克隆子的PCR检测　　

2.1.1  ITS序列扩增 　　在以特异引物作为PCR反应引物的条件下，所得的条带约在750 bp处，条带清楚，方便PCR产物的回收、纯化（图1）。　　

2.1.2  菌落PCR、质粒PCR鉴定重组质粒 　　在以P1，P2作为引物的条件下，进行菌落PCR和质粒PCR鉴定，经琼脂糖凝胶电泳可以看出，所得序列约在750 bp左右，可以确定克隆成功（图2）。　　

2.2  赤水金钗石斛测序结果及分析     用ClustalX软件对测序结果比对，发现50株赤水金钗石斛ITS序列（包括ITS1，ITS2与5.8S）完全一致。赤水金钗石斛在8位缺失碱基C，在12位缺失碱基A，在82位为碱基A；来自云南丽江和来自海南的金钗石斛株在30位为T，在204位为G。克隆测序结果与直接测序结果完全一致（图3）。测序结果已登录基因库，序列号：EF618732。1～5分别为以质粒、菌落为模板扩增的ITS序列；M: DNA标准参照物DL2000　　

2.3  构建系统树    根据不同地区金钗石斛测序结果计算其遗传距离；用MEGA软件以NJ法（邻接法）构建了系统树（图4）。　　

3  讨 论    由于ITS片段在核基因组内是高度重复的,不同重复序列间的纯合程度可能不同。通过不等交换和基因转换，核rDNA 重复单位间已经发生了位点内或位点间的协同进化，即不同拷贝的序列趋于相近或完全一致，这就为对PCR扩增产物直接测序奠定了理论基础。但如果rDNA重复序列间的纯合程度较低，各重复单位间序列差异较大，特别是当细胞中有一个以上的基因位点时，直接测定PCR产物的序列，可能导致读不出序列，只测一个PCR产物的克隆序列也不能较好反映重复序列间的变异。另一方面，如果PCR产物中不同重复序列的浓度比较平均的话，直接测序可直接确定重复序列间的变异情况，因为发生变异的核苷酸会在同一位点上显示出来。为了得到准确的赤水金钗石斛ITS序列的信息，我们在实验当中分别采用了PCR产物直接测序法和克隆测序法，通过对两种测序结果的比对分析，发现两种测序方法所得ITS序列一致。说明赤水金钗石斛rDNA 重复序列间的纯合程度很高，PCR产物直接测序就可以反映出ITS区的序列。本试验通过克隆测序验证了这一结论，而且更进一步说明赤水金钗石斛进化稳定，在赤水地区，金钗石斛种群没有突变位点。可将本次实验测序结果作为赤水道地药材金钗石斛的分子标记。   

根据赤水金钗石斛的测序结果，并与基因库登录的金钗石斛ITS对照，赤水金钗石斛ITS1与ITS2序列的起止范围分别为1～231 bp和395～636 bp。赤水金钗石斛在8位缺失碱基C，在12位缺失碱基A，在82位为碱基A；聚类分析图，可以看出赤水金钗石斛与其他地区金钗石斛存在个别碱基差异，在遗传距离0.000 5处，可将6个不同地区的金钗石斛分为6个聚类群，其中云南和海南金钗石斛聚在一枝，可能是由于两个地方都是亚热带气候，导致他们进化一致。可以得出：（1）金钗石斛ITS1序列基因多态性比ITS2序列更显著。（2）本研究结果为赤水金钗石斛鉴定提供了新的分子依据、补充了新的遗传数据。

 

【参考文献】  　　［1］Coleman AW, Jeffrey CM. Ribosomal DNA ITS1 and ITS2 sequence comparisons as a tool for predicting genetic relatedness ［J］. J Mol Evol,1997,45（2）:168-177.　　［2］丁小余, 王峥涛，徐珞珊，等. F 型、H 型居群的铁皮石斛rDNA ITS区序列差异及SNP现象的研究［J］. 中国中药杂志, 2002,27(2):85-89.　　［3］沈洁,丁小余，贺佳，等. 泽泻rDNA ITS区序列特征及其居群鉴别研究［J］. 南京师大学报：自然科学版,2005,28(3):86-88. 　　［4］肖鲲,葛晓军,李小琼,等.改良CTAB法提取石斛总DNA［J］.贵阳医学院学报,2007,13(2):21-25.　　［5］肖鲲,葛晓军，李小琼，等. 金钗石斛及其相似种RAPD优化和DNA多态性分析［J］.江苏大学学报：医学版，2007,17(2):134-137.　　［6］Douzery EJ,Pridgeon AM, Kores P,et al. Molecular phylogenetics of Diseae(Orchidaceae)：a contribution from nuclear ribosomal ITS Sequence［J］. Am J Bot,1999, 86(6) : 887-892.