铁皮石斛的DNA分子鉴别

铁皮石斛的DNA分子鉴别

随着PCR技术的不断发展，DNA分子标记技术逐渐被应用于中药材的鉴定研究。石斛种类繁多，尤其当加工成枫斗后，传统的鉴定方法难于准确的鉴别，分子标记鉴定技术为石斛的鉴别开辟一条新的途径。

张铭等用随机多态性(RAPD)技术对石斛属内26个种和金石斛属的1个种进行了基因组DNA多态性分析.并构建聚类树状图。在对石斛属26个种的RAPD图谱聚类分析基础上，挑选出铁皮石斛特异性条带，进行测序.在符合PCR引物设计的原则下，将原RAPD引物向3端延长至20bp.当有样品需要鉴定时，提取样品DNA后，再用探针对它进行一次PCR反应，经电泳检测便可达到准确鉴别样品真伪.所以，用此特异性引物进行鉴别时不需再用铁皮石斛作对照实验，只要电泳图谱上出现条带即为直品。由于鉴别PCR所用的是高特异性PCR引物.扩增反应的复性温度高、特异性强，一般的DNA污染不会影响鉴定结果，对实验操作的要求也不如RAPD苛刻，所以这种鉴别技术较易掌握，具有很大的实用价值。

  丁小余等报道了枫斗类石斛rDNA ITS的全序列数据库及其分析鉴别。

  对枫斗类石斛的rDNA ITS区序列进行测序及分析，建立了21种枫斗类石斛的rDNA ITS全序列数据库，枫斗类石斛在该区的种间差异显著而稳定，转换和颠换总数为11-122,变异位点数为341，信息位点数为195。与外类群植物云南石仙桃间的差异较大，转换和颠换总数为131-161。枫斗类石斛居群间的差异较小.转换和颇换总数为0-6,

    运用枫斗类石斛rDNA ITS区数据库对待检种进行DNA鉴别的全过程可分为3个步骤:①首先将待检种的rDNA ITS区全序列测出。此过程包括待检种的总DNA提取、ITS区的全序列扩增、PCR产物的纯化、ITS区的测序等过程。②利用CLUSTAL, MEGA等软件将待检种的序列与数据库中各枫斗类石斛的rDNA ITS区全序列进行分析比较。③序列间无差异的种或差异性最小的种即为该种枫斗类石斛的具体种。待检种将与所属种一起被聚类于同一分支上.且置信度为100%.

    运用此方法，作者己成功鉴别了隶属于枫斗类石斛的待检品I、2, 3和4(来自浙江乐清的枫斗加工地)，它们分别是齿瓣石斛(待检种I)、兜唇石斛(待检种2)、铁皮石斛(待检种3)和杯鞘石斛(待检种4)，这些种在无花无叶状态下是难以鉴别其种类的。各待检种的rDNA ITS区个序列经CLUSTAL和MEGA软件运算，在所构建的NJ树上与各自所属的石斛种聚类为同一支，与数据库中对应的石斛种在rDNA ITS区的序列上无差异，且置信度应为100%.